[发明专利]利用紫外线放射对活细胞进行3D成像

说明书

技术领域

本发明总体上涉及光学层析成像系统，更具体地，涉及用于3D显微镜法的光学投影层析，在所述3D显微镜中利用紫外线放射照射诸如生物细胞的微小对象来伪投影成像和重建到3D图像中。

背景技术

纳尔逊(Nelson)推动了使用光学层析对生物细胞成像的发展，例如在2003年2月18日授权的、题为“Apparatus and method for imaging small objects in a flow stream using optical tomography”的美国专利No.6,522,775中所公开的，其全部公开内容被作为参考而被整体合并于此。在福沃尔(Fauver)等于2003年11月18日提交的美国专利申请号为10/716,744、并于2004年4月22日公开的美国公开号为No.US-2004-0076319-A1的、题为“Method and apparatus of shadowgram formation for optical tomography”的美国专利申请(福沃尔’744)以及福沃尔等于2006年9月18日提交的美国专利申请号为11/532,648的、题为“Focal plane tracking for optical microtomography”的美国专利申请(福沃尔’648)中对该领域的进一步发展给出了启示，上述专利申请的全部公开内容作为参考而被整体合并于此。

光学层析系统中的处理从样本准备开始。通常，从医院或诊所接收从患者那里采下的样本，处理该样本以移除非诊断性要素，固定该样本，然后对该样本染色。被染色的样本然后与光学胶体混合，并被插入毛细管中，之后通过使用光学层析系统来生成样本中对象(诸如，细胞)的图像。产生的图像包括一组来自不同透视法的延伸景深的图像，该图像被称为“伪投影图像”。这组伪投影图像可以通过使用反向投影和滤光技术而被重建，以产生感兴趣的细胞的3D重建。在全部三维上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D层析细胞成像中是有利的，尤其是量化图像分析中是有利的。

然后，3D重建对于分析依然可用，从而能够对感兴趣的结构、分子或分子探针进行量化以及位置确定。诸如生物细胞的对象可以用至少一种染料或带标签的分子探针来标记，且所测量的该生物标记的数量和位置可以产生关于细胞的疾病状态的重要信息，包括但不局限于诸如肺癌、乳癌、前列腺癌、子宫颈癌、胃癌和胰腺癌等各种癌症。

本公开允许将光学投影层析扩展至活细胞成像，并期望促进细胞分析、药物开发、个人化疗法和相关领域。到目前为止，活细胞显微镜检查传统上是由非标记2D成像技术来完成的，所述非标记2D成像技术为诸如相位对比、DIC和偏振对比显微镜法。

通过使用250nm到290nm波长的深紫外线(DUV)来进行天然吸光(native absorbance)和荧光成像在技术上很有挑战，并且在被放射的细胞中会造成光毒性反应。最近以来，已使用活体染料，该活体染料通常发射用于3D活细胞成像的荧光信号，因为商业显微镜(共焦的、去卷积的和多光子激励的多种种类的显微镜)依赖于荧光来创建用于生成3D图像的多个平面层。然而，在这种情况下，由一堆2D图像形成的3D图像在每个层内的纵向分辨率是横向分辨率的大约四分之一，从而使得量化分析不精确。在全部三维上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D层析细胞成像中是非常有利的，尤其是量化图像分析中是非常有利的。

使用DUV照射活细胞的一个优点是天然DNA和蛋白质分别吸收260nm和280nm的光，而不用使用任何必须渗入细胞膜和有时渗入细胞核膜(在非正常状态下)的光化标签。而且，标签或染料只是要测量目标蛋白质或核苷酸(DNA)的中间步骤，这给该测量增加了很大程度的可变性。排除这种外源物种将会潜在地改善蛋白质或核苷酸(DNA)的量化测量的准确性，而且通过排除样品准备中的步骤能减少时间、经历和复杂性。不幸地，由于激发强信号需要大剂量的放射，DUV照射的使用在过去表明存在光毒性反应。

最近，然而，展示了通过使用DUV发光二极管(LED)来在260nm和280nm下对的活的培养的人和老鼠细胞进行DUV成像(例如参见Zeskind，BJ等的“P.Nucleic acid and protein mass mapping by live cell deep ultraviolet microscopy，”Nature Methods 4(7)：567-569(2007))。