[发明专利]体外连接和组合装配核酸分子的方法

权利要求书

1.连接一组两个或更多个双链(ds)或单链(ss)DNA分子的体外方法，其中待连接的邻近DNA分子在其末端处含有重叠序列，所述方法包括将所述两个或更多个DNA分子在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步反应中形成第一装配dsDNA分子的条件下在单个容器中在体外与下列接触

(a)缺少3′核酸外切酶活性的分离的非热稳定5′至3′核酸外切酶，

(b)群集剂，

(c)具有3′核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换DNA聚合酶，或者所述DNA聚合酶与缺少3′核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物，

(d)分离的热稳定连接酶，

(e)dNTP的混合物，以及

(f)适合的缓冲液。

2.权利要求1所述的方法，其中(a)的所述核酸外切酶是T5核酸外切酶并且所述接触是在等温条件下。

3.权利要求1的所述方法，其中

(b)的所述群集剂是PEG，和/或

(c)的所述非链置换DNA聚合酶是Phusion^TM DNA聚合酶或VENTDNA聚合酶，和/或

(d)的所述连接酶是Taq连接酶。

4.权利要求1所述的方法，其中所述条件还适于在所述连接反应后消化任何不成对的非同源的单链DNA。

5.权利要求4所述的方法，其中所述待连接DNA分子中至少一些在一个末端包含与任意感兴趣的所述DNA分子不同源的序列。

6.权利要求5所述的方法，其中所述非同源序列包含一个或更多个PCR引物的结合区域，和/或

与载体序列同源的区域，和/或

一个或更多个限制酶的识别位点。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，进一步包括重复所述方法来彼此连接第二组两个或更多个DNA分子，以获得第二装配DNA分子，然后连接所述第一和所述第二装配DNA分子，以获得第三装配ds DNA分子。

8.用于连接一组两个或更多个双链(ds)或单链(ss)DNA分子的一步体外反应试剂盒，其中待连接的邻近DNA分子在其末端含有重叠序列，所述试剂盒在单个容器中包含

(a)缺少3′核酸外切酶活性的分离的非热稳定5′至3′核酸外切酶，

(b)群集剂，

(c)具有3′核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换DNA聚合酶，或者所述DNA聚合酶与缺少3′核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物，

(d)分离的热稳定连接酶，

其量使得当在适合的缓冲溶液和dNTP存在的情况下将所述两个或更多个DNA分子添加到所述试剂盒并且在等温条件下温育时，所述两个或更多个DNA分子在协同反应中被装配。

9.权利要求8所述的试剂盒，其包含

(a)T5核酸外切酶，

(b)PEG，

(c)Phusion^TM DNA聚合酶，以及

(d)Taq连接酶。

10.修饰全核酸分子性质的方法，所述方法包括：

(a)将所述全核酸分子的核酸序列沿其长度代表性地分成多个部分，从而鉴定部分核酸分子的所述序列；

(b)对于至少3个所述部分核酸分子，提供每个部分核酸分子的多个变体；

(c)将所述变体与没有被改变的任意部分核酸分子在体外组合装配在一起，其中所述部分核酸分子或其变体在其末端处含有重叠序列，由此所述部分核酸分子和其变体在所述混合物中的装配将导致所述全核酸分子的多个变体的装配；以及

(d)表达所述全核酸分子的所述变体，以确定所述全核酸分子的所述变体的任何被修饰性质。

其中步骤(c)的所述装配通过权利要求1所述的方法进行。