[发明专利]体外连接和组合装配核酸分子的方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年2月15日提交的美国申请序列号61/029,312；2008年2月15日提交的U.S.61/064,107；2008年5月12日提交的U.S.61/052,614；2008年9月18日提交的U.S.61/098,202；和2008年12月31日提交的U.S.61/142,101的权益。这些申请的内容通过引用全部并入本文。

技术领域

本发明涉及体外连接单链和/或双链核酸分子的方法，其允许有效地一步装配多个具有重叠末端序列的核酸分子。本发明方法在实施系统组合装配核酸序列变体片段以修饰被连接核酸序列的性质中是特别有用的，核酸序列例如提供密码子使用、控制序列、基因、途径、染色体、染色体外核酸和基因组的变体的核酸序列。

背景技术

基于循环变温仪的两步法被用来装配部分生殖道枝原体(M.genitalium)基因组，如Gibson，D.G.等，“Complete chemical synthesis，assembly，and cloning of a Mycoplasma genitalium genome.”Science(2008)319：1215-1220中所述。Li，M.Z.等.，Nature Meth.(2007)4：251-256描述了另一种方法。采用T7 5′核酸外切酶和单链DNA结合蛋白的单步装配方法公开在PCT公开WO2006/021944中。本发明公开了一步方法，其促进DNA分子在体外的装配。这些方法采用缺少3′核酸外切酶活性的非热稳定5′核酸外切酶或在dNTP存在的情况下起作用的3′核酸外切酶。

这些新方法在本发明的另外的方面中是特别有用的，其提供系统组合装配以修饰核酸分子。用于高通量筛选中的化学化合物装配的组合技术这时已经被充分建立。另外，基因改组技术——其中编码序列被随机片段化和再退火——已经实践了许多年。例如，用以创建嵌合基因片段文库的方案描述在Meyer，M.等，“Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library of Chimeras”Current Protocols in Protein Science(2006)26.2.1-26.2.17；McKee，A.E.等，JBEI摘要中。然而，对于组合方法的系统方法存在需求，其不依赖随机重排或改组以提供优化的核酸序列，例如，具有优化的编码序列或代谢途径的优化的核酸序列，所述优化的核酸序列可以根据期望的性质进行选择。本发明通过提供用以装配多种感兴趣核酸的系统组合方法而满足了该需求。

用于将各种组分装配到全基因组或最小基因组中的技术已经被创立。例如，2007年11月15日公布的美国专利公开2000/0264688描述了构建合成基因组的方法，其通过产生和装配包含部分基因组的序列盒进行。装配核酸的逐步分级方法描述在2007年1月4日公布的美国专利公开2007/004041中。然而，没有表明系统地使用这些技术来装配期望的核酸分子。

可以理解的是，基因组的构建不需要包括所有天然存在的组分。PCT公开WO2007/047148描述了基于生殖道枝原体的最小基因组，其中多达101个编码蛋白的基因可以被省略并且仍保持生存力。没有表明最小基因组的组分被系统装配为允许形成多种可选最小基因组的组合文库。

因此，本发明涉及系统方法和其产物，其允许核酸分子的有效和广泛修饰以便以高通量的方式提供和筛选感兴趣的核酸装配物，并且容易适应机器执行。在可选的实施方式中，与在反应管中相对，装配反应可以在固体表面上进行，例如，在使用微观流体的芯片上(如Huang，Y.等，Lab Chip(2007)7：24-26中所显示)。

用于系统组合装配核酸——其代表(表现)变体编码序列、表达系统、途径合成和最小或较大基因组——的技术至少部分采用体外装配技术。可以采用任何适合的体外装配技术；然而，本发明的方法包括对本领域中已经描述的那些方法的改进。

发明内容