[发明专利]改良的检测潜在丙型肝炎的分析方法,其用途和相应的诊断试剂盒

说明书

发明领域

本发明属于丙型肝炎病毒(HCV)的鉴别和检测技术领域。

更具体而言，本发明提供了用于检测所述病毒C的一种改良的分析方法及其相应的诊断试剂盒，其在鉴别和检测所谓的“潜在HCV感染”中特别有用，该感染不能使用当前的标准分析方法在血清或血浆样品中检测到。

现有技术状态

HCV是动物病毒黄病毒科肝炎病毒属的成员。HCV基因组(下文中称为HCV-RNA)由约9.4千碱基(kb)长的正极性单链RNA分子构成。据推测，HCV复制通过与病毒基因组RNA分子互补的负链RNA链的合成进行，所述负链RNA链随后作为合成新的基因组RNA分子的模板。尽管肝脏是HCV感染的主要靶器官，该病毒可潜在的感染人体内任何类型的细胞、组织或器官。

当前，已具有通过检测血清或血浆样品中针对HCV抗原的抗体(下文中称为抗-HCV)或HCV-RNA无障碍诊断患者的HCV感染的技术。

然而，最近描述了一类HCV感染，其特征在于其是“血清学沉默的”，其中感染的患者在抗-HCV或HCV-RNA商用检测试剂盒的血清或血浆检测中不产生阳性结果(下文中称为潜在的感染)。

此类患者的通常情况是肝功能检测中长时间的异常结果，即异常高水平的肝酶。在这些患者中评价了所有或大部分的已知肝病原因，基于分析、临床或流行病学数据，其均被排除在外，例如，乙型肝炎病毒感染(患者对血清乙型肝炎表面抗原和HBV-DNA阴性)、HCV(患者对血清抗-HCV和HCV-RNA阴性)、慢性自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、吉尔伯特氏综合征、胆汁性肝硬化，以及伴随肝损伤的风险因素，如饮酒、吸毒、服药、输液、文身、体穿孔、胡乱性行为等的自身免疫、代谢和遗传病症。

我们因此研究了当前分析方法不能解释的肝功能改变的人群，其原因可能是某种形式的丙型肝炎病毒的潜在感染。由于该感染不能通过当前方法快速、有效和安全的诊断，此类感染具有两个非常重要的后果：

-首先，从患者自身的角度，这些患者与可以使用当前的分析方法在血清或血浆中检测疾病的患者相比总体而言是不利的，因为对于后者专科医生可研究其具体症状并向其提供最合适的治疗。

-其次，从携带者和专科医生均缺乏所述疾病知识导致所述疾病的流行和传播的角度。因此，感染所述潜在形式的丙型肝炎病毒的患者在其外周血的单核细胞中携带HCV-RNA，而非血清中，这是血液和器官捐献、血液透析等要考虑的问题，因为他们可能在不怀疑该因素的情况下被感染。另一方面，疾病知识将使专科医生能告知患者基础的安全措施，以防止其日常生活中的不期望感染。

在该技术领域内，由于结果的可靠性，研究人员使用免疫测定作为常规的实验室检验。酶联免疫测定(EIA)是尤其通常使用的检验，因为它是一种简单、重现性的客观方法，能在短时间内处理大量的体液样品，利于在不太复杂的实验室进行。

当前已有用于检测血液中抗-HCV的商用免疫测定。这些EIA检测针对HCV的结构(核心和外壳)和非结构(NS)蛋白的抗体。另一方面，商用EIA检测血液中抗-HCV的灵敏度根据固相上涂覆的是哪种HCV抗原，它们是单独的或融合的蛋白或肽片段而不同。

检测人血清或血浆中抗-HCV的商用EIA包括下列活性成分：

-涂覆HCV抗原混合物的固相(例如微量培养板孔)：核心和/或E2/NS1和/或NS3和/或NS4和/或NS5。大多数市面上的EIA包括至少一种NS3和NS4核心抗原。

-反应的阴性和阳性对照，

-样品稀释剂，

-洗涤溶液，

-缀合物稀释剂，

-缀合物，

-底物缓冲液和/或底物溶液，

-终止溶液。

用于检测抗-HCV的商用EIA方法作用的技术领域是“经典”的HCV感染。这些EIA称为EIA筛选，被用于筛选可能与HCV接触的个体群体样品，其在经典HCV感染的患者中显示行之有效的或99％或以上的特异性和接近于100％的分析灵敏度。

商用EIA方法的特异性在免疫活性群体受试者中下降，例如志愿献血者、保健专业人员、监狱职工或军事人员。类似的，其灵敏度在免疫受损的个体中较低[信息来自亚特兰大疾病预防和控制中心，USA，根据其出版物：发病率和死亡率每周报道2003；52(No.RR-3)：1-13]。