[发明专利]用于核酸测序的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求如下美国临时专利申请的权益：美国临时专利申请系列号61/072,160，申请日2008年3月28日，以及美国临时专利申请系列号61/099,696，申请日2008年9月24日，其内容已完整纳入本文作为参考。

本申请还涉及美国临时专利申请系列号61/139,402，申请日2008年12月19日，美国专利申请系列号[未分配]，申请日2009年3月27日(代理人备案系列号01-007701)和美国专利申请系列号[未分配]，申请日2009年3月27日(代理人备案系列号01-005902)，其完整内容已纳入本文作为参考。

有关联邦资助的研究的权利声明

无

发明背景

遗传密码是所有生命构架的蓝图，对遗传密码了解的能力已经在无数领域产生了巨大的进步。从诊断疾病的能力到鉴定进化联系和/或多样性的能力、操作遗传框架开发新材料和组合物的能力，这种了解为我们取得不可胜数的进展开启了大门，这些进展已经使人类获益良多，并且将继续受益。

这些进步就整体而言是涉及阅读遗传密码和/或确定遗传密码特征的技术方面的进步。例如，核酸测序技术的开发使我们能够以逐个碱基的方式确定核酸序列，并将遗传密码定位到整个人类基因组上。其他方面的进展包括以快速阵列为基础的技术，该技术可以使我们更合理地确定患者或其他生物样本的遗传模式。

每一个技术进步都使我们有机会通过与那些先进领域有关的相关或辅助技术进一步提高技术水平。例如，荧光染料化学的进展促进了遗传技术的许多进步，使我们能够对生物反应及其产物进行简单的分析。另外，微流体技术的开发提高了液体和试剂操作的水平，其达到的重复性水平是以前通过更常规的方式所无法达到的。

本发明涉及遗传分析中所用的改良工艺、系统和组合物，这些工艺、系统和组合物可以提高这些分析的精确度并使之更便于使用。

发明概述

本发明提供了改良的核酸模板构建物、组合物、试剂盒和包含这种构建物的系统以及制备和使用这种构建物的方法。

在第一方面，本发明提供了确定模板核酸区段中所含的共有核苷酸序列的方法。该方法包括在一个毗连核酸分子中提供模板核酸区段的正义和反义链。然后利用聚合酶介导的模板依赖的测序方法测定正义和反义链的序列，进而根据正义和反义链的序列确定靶核酸区段的共有序列。

在一个相关方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含具有第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸。第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核酸的两条链相连，第二发卡寡核苷酸在第二末端与模板核酸的两条链相连。然后利用模板指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸至少一条链的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含具有第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸，其中第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核酸的两条链相连，然后利用模板指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸的核苷酸序列。

在其他方面，本发明提供了测定核酸区段序列的方法，该方法包括提供一个模板核酸区段。片段包含第一和第二互补核酸链，第一链将连接第一核酸区段3’端的核酸连接到第二核酸区段的5’端，第二链将连接第一核酸链5’端的核酸连接到第二核酸链的3’端。然后模板核酸与引物序列接触，其中引物序列与模板核酸的至少一部分互补。然后通过监测模板依赖的引物延伸反应确定模板核酸的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含双链区段的模板核酸，其中双链区段包含第一和第二互补链以及至少一个将第一链3’端连接到第二链的5’端的第一单链寡核苷酸区段；以及监测模板依赖的合成反应过程中掺入的核苷酸来测定第一链、连接寡核苷酸区段和第二链的核苷酸序列。

在其他优选方面，在上述一个或多个类似寡核苷酸或发卡寡核苷酸内提供对照序列，如引物识别序列等。

在相关的方面，本发明提供了测定模板核酸区段的共有核酸序列的方法，其中在一个毗连核酸分子内提供模板核酸区段的正义和反义链。毗连核酸分子与引物序列接触和/或形成复合物，其中引物序列与毗连核酸分子的至少一部分互补，在聚合酶、多种核苷酸或核苷酸类似物存在的情况下形成核苷酸合成复合体，其中各个核酸合成复合体被沉淀到底物上，这样就可以通过光学方法测定各个复合体。然后监测和/或检测核酸合成反应中被各个复合体以模板依赖的方式掺入的核苷酸或核苷酸类似物的序列以确定正义和反义链的核酸序列。然后利用或比较正义和反义链的核酸序列以确定模板核酸的共有序列。