[发明专利]β-淀粉酶、编码其的基因和其制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及新的β-淀粉酶。具体涉及微生物来源的β-淀粉酶、其基因、其制造方法等。

背景技术

以往，已知β-淀粉酶来源于大豆、小麦、大麦、麦芽、白薯、马铃薯等植物。其中，从大豆、小麦、大麦、麦芽等谷类中提取并纯化的β-淀粉酶，由于用于制造在制糖业、面包制造业、和酿造工业中使用的含有麦芽糖的糖浆等，因此被广泛应用于工业中。植物起源的β-淀粉酶中，大豆来源的β-淀粉酶的酶活性高，耐热性也优异。

然而，近年来，由于生物乙醇的需求扩大，因而玉米的价格高涨。受此影响，种植由大豆、小麦转向玉米。因此，大豆、小麦、大麦等变得短缺，价格高涨，现在要确保β-淀粉酶的原料也变得困难了。

β-淀粉酶是一种作用于主链为淀粉、糖原等葡萄糖的α-1，4键的多糖类，并从非还原性末端、以麦芽糖为单元分解的酶。以前就已了解β-淀粉酶存在于大豆、麦类等高等植物中。自1972年，发表了微生物中也存在呈现与高等植物β-淀粉酶相同作用机制的酶以来，已经发现了许多微生物是β-淀粉酶生产菌(非专利文献1)。

迄今为止，已经报到了蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、巨兽芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、以及嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)等芽孢杆菌属、或链霉菌属(Streptomyces sp.)、或假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等为生产β-淀粉酶的菌。然而，它们大多生产低，很少能达到实用化。

另一方面，曲霉菌属等丝状菌生产的淀粉酶按末端型分解直链淀粉、支链淀粉。因此，在使用该淀粉酶时，除了麦芽糖之外，大多还生成葡萄糖、麦芽三糖、其它寡糖。而且，该淀粉酶耐热性也低，作为麦芽糖生产用的实用性低。

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生产耐热性高的麦芽糖生成酶(专利文献1、非专利文献2)。该酶从淀粉的非还原性末端开始，按外切型生成麦芽糖，但生成的麦芽糖为α型。而且，据报道，该酶不是像植物起源的β-淀粉酶那样严密地按麦芽糖单元加水分解，而是在反应初期，生成麦芽四糖(G4)、麦芽三糖(G3)和麦芽糖(G2)，以及少量麦芽戊糖(G5)和麦芽己糖(G6)，将Shardinger糊精分解为麦芽糖和葡萄糖，并将麦芽三糖分解为麦芽糖和葡萄糖。因此，淀粉分解物中由于该酶的作用而含有6～8％的葡萄糖。因此，该酶不适于高纯度的麦芽糖糖浆的制造。

专利文献

专利文献1：特开昭60-2185号公报

非专利文献

非专利文献1：工业用糖类酶手册(工业用糖质酵素ハンドブツク)、講談社サイエンテイフイツク、1999年

非专利文献2：H.Outtrup和B.E.Norman等Starch，第12卷、第405～411页

发明内容

如上文所述，对于现在β-淀粉酶的主流的植物起源的β-淀粉酶而言，难以进行稳定的供应。而且，从植物中获得的酶量一定，其生产量有限度。另一方面，微生物来源的β-淀粉酶，由于生产率低、或大量培养困难等原因，很少能实现实用化。

本发明人鉴于上述问题，反复进行了积极的研究。其结果发现，作为枯草菌的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)生产具有与大豆来源的β-淀粉酶相匹敌的耐热性的β-淀粉酶。此外，本发明人分离并纯化了该β-淀粉酶，并成功地测定了该酶化学性质。此外，还成功测定了编码该β-淀粉酶的基因的碱基序列。另外，确认了采用导入了含有该基因的载体的转化体，可以制造β-淀粉酶。

本发明基于以上成果而完成，内容如下。

[1]弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)来源的β-淀粉酶。

[2]具有下述酶化学性质的β-淀粉酶：

(1)作用：作用于多糖类和寡糖类的α-1，4糖苷键，将麦芽糖游离；

(2)底物特异性：良好地作用于淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖、麦芽庚糖，而不作用于普鲁兰多糖(pullulan)、葡聚糖、环糊精、麦芽三糖；

(3)最适温度：约55℃；

(4)最适pH：约8.0；

(5)温度稳定性：在55℃以下稳定(pH 5.0、10分钟)；

(6)pH稳定性：在pH 4～9稳定(30℃、3小时)；

(7)分子量：约60000(SDS-PAGE)。