[发明专利]PARP相互作用分子的鉴定方法和PARP蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及固定化合物(immobilization compound)和用于鉴定PARP相互作用分子的方法和用于纯化PARP蛋白的方法。另外，本发明涉及例如用于治疗癌症、代谢性疾病或自体免疫/炎症性障碍的包含所述相互作用分子的药物组合物，和涉及癌症的诊断方法。

聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)组成真核细胞中存在的细胞信号传导酶的家族，所述酶催化DNA-结合蛋白的聚(ADP-核糖基化)。PARPS还已知为聚(ADP-核糖)合成酶或聚(ADP-核糖)转移酶(pART)。这些酶在对DNA损伤的速发型细胞应答方面起重要作用。对由电离辐射、氧化应激和DNA-结合抗肿瘤药诱导的DNA损伤的应答，PARP将ADP-核糖单元添加到靶蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧酸酯基上。该聚(ADP-核糖基化)为通过附着ADP-核糖单元的复杂支链聚合物上触发受体蛋白失活的翻译后修饰(Schreiber等，2006.Nature Reviews CellBiology 7，517-528)。

ADP核糖基化为一种翻译后蛋白修饰，该修饰中ADP-核糖部分从NAD转移到靶蛋白的特定氨基酸侧链上(Schreiber等，2006.NatureReviews Cell Biology 7，517-528)。

PARP1为PARP家族中首个被表征的成员，并且是最熟知的成员。由ADPRT基因编码的该蛋白是高度保守的染色质结合酶，所述酶结合带切口的DNA并且介导针对DNA损伤的保护。对重大DNA损伤的应答，PARP1被过度激活，并且诱导细胞NAD+和ATP的耗尽，导致细胞功能障碍或细胞死亡。PARP1的过度激活涉及几种疾病的发病机理，所述疾病包括中风、心肌梗塞、糖尿病、神经退行性疾病和炎症疾病。

已经提出使用小分子抑制剂靶向PARP作为用于癌症治疗的有前景的方法(Haince等，2005.Trends Mol Med.11(10)：456-63)。在文献中已经报道了几种PARP抑制剂。然而，第一代的PARP抑制剂对于PARP家族的各种成员是非选择性的，存在对选择性抑制剂的需要。另外，还需要用于PARP抑制剂的选择性剖析(profiling)的新方法。

PARP抑制剂的鉴定和表征的一个前提条件是提供合适的检测方法，优选是使用靶蛋白生理形式的检测方法。本领域中，为了解决该问题已经提出几种策略。

为了对来自小牛胸腺的PARP蛋白进行纯化，描述了两步亲和纯化策略(D’Amours等，1997.Analytical Biochemistry 249，106-108)。第一步由DNA-纤维素色谱组成，第二步由3-氨基苯甲酰胺亲和色谱组成。3-氨基苯甲酰胺是一种PARP抑制剂，与所述酶的C-末端催化结构域相互作用。

常规而言，可以在基于溶液的检测中使用合适的底物使用经纯化的酶或重组酶测定PARP酶活性(Dantzer等，2006.Methods inEnzymology 409，493-510)。这种类型的检测可用于鉴定PARP抑制剂，还可用于通过测试针对PARP家族的所有成员的抑制剂而评估抑制剂选择性。

综上所述，需要为PARP相互作用化合物的鉴定和选择性剖析以及为PARP蛋白的纯化提供有效工具和方法。

发明内容

本发明尤其涉及式(I)的固定化合物或其盐，

其中：

R^1a、R^1b、R²独立地选自由H和C_1-4烷基组成的组，其中C_1-4烷基可选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；