[发明专利]用于测量细胞增殖的双标记法

说明书

发明领域

本公开内容涉及用于双脉冲标记核酸的方法。

相关领域的描述

通常通过向在其中培养细胞的培养基中或饲喂动物的饮用水中加入核酸糖类似物(核苷)，或通过将其注射入待标记的动物中来进行以测定生长速率为目的的脉冲标记细胞DNA。对DNA类似物的定时暴露(其具有将该DNA类似物掺入活跃地合成的DNA的潜能)被定义为脉冲。用于脉冲标记DNA的标准方法包括使用5-溴2′-脱氧尿苷(BrdU)或放射性标记的核苷类似物。

用于检测BrdU标记的DNA或放射性标记的DNA的方法在本领域内是熟知的。例如，可用抗BrdU单克隆抗体，然后用荧光标记的二抗处理含有BrdU标记的DNA的细胞。然后可通过标准技术，包括板测定、荧光显微术、成像、高内涵筛选或流式细胞术来显现和定量荧光标记。

剖析复杂的细胞过程(包括细胞增殖)，需要跟踪生物分子(当它们在它们的原住地(native habitat)中行使功能时)的能力。近年来，用于标记生物分子的可选工具已从化学生物领域显现出来--生物正交化学报道分子(bioorthogonal chemical reporter)。已描述了生物正交反应部分用于检测代谢物和翻译后修饰的用途(使用叠氮化物部分作为生物正交化学报道分子)。在通过代谢或通过化学修饰导入靶生物分子后，可通过使用下列3个高选择性反应之一而用探针标记叠氮化物：Staudinger连接、Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成作用或张力提高的(strain-promoted)[3+2]环加成作用。Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46)：15046-7。

生物正交化学报道分子之前已用于通过掺入核苷似类物而标记核酸。因此，可使用生物正交标记例如Staudinger连接、叠氮化物和炔烃的Cu(I)-催化的[3+2]环加成作用(“点击化学”)或“无铜”点击化学(其独立地由Barry Sharpless和Carolyn Bertozzi描述)脉冲标记DNA。Sharpless等人Angew Chem Int Ed Engl.2002 Mar 15；41(6)：1053-7(通过引用完全合并入本文)；Meldal等人J.Org.Chem.2002，67，3057(通过引用完全合并入本文)；Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46)：15046-7(通过引用完全合并入本文)；美国专利7,122,703；美国申请案2003000516671。点击化学和Staudinger连接适合于通过直接检测核苷酸掺入来测量细胞增殖。参见Salic等人，Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids，美国申请案20070207476和20070099222(于2006年10月27日提交)(通过引用完全合并入本文)。

术语“点击化学(click chemistry)”是指在铜(I)催化剂存在的情况下进行的[3+2]环加成反应。铜(I)催化剂可由铜(I)离子或铜(I)螯合部分组成。铜(I)螯合部分可以是“其特征在于存在2个或更多个可参与铜(I)离子配合物(含有多于一个的配位键)的形成的极性基团的任何实体”。Salic等人，美国专利申请案20070207476(同上)。铜(I)螯合剂在本领域内是熟知的，包括但不限于新亚铜试剂(neocuproine)和浴铜灵二磺酸盐(bathocuproine disulphonate)。Salic等人，美国专利申请20070207476和Sharpless等人，美国申请案2003000516671。

[3+2]环加反应也称为1，3偶极环加成，其可在1，3-偶极子与亲偶极试剂(dipolarophile)之间发生。1，3-偶极子与亲偶极试剂的实例在本领域内是熟知的。例如，1，3-偶极子可以是叠氮化物，亲偶极试剂可以是炔烃。

用于脉冲标记DNA的点击化学技术包括用含有反应性不饱和基团的第一核苷类似物处理细胞以便将第一核苷类似物掺入新合成的DNA中。然后，将细胞与包含第二反应性不饱和基团的连接至标记物的试剂接触，以便在第一与第二反应性不饱和基团之间发生[3+2]环加成作用。

用于脉冲标记DNA的[3+2]环加成反应的下列描述仅作为例子提供并且无意限定本发明的范围。