[发明专利]筛选产生生物活性剂的单细胞的方法

说明书

发明领域

本发明一般涉及用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。

引言

通常期望筛选产生一种或多种生物活性剂的单细胞或细胞小群体。这样的信息可用于确定细胞暴露于生物活性剂后的状态或活性以确定这些生物活性剂对细胞的作用，所述生物活性剂例如候选药物诸如小分子、蛋白或siRNA。这样的信息还可用于鉴定表达生物活性剂的特定变体例如SNP或抗体的细胞。这样的信息还可用于鉴定编码感兴趣的生物活性剂例如抗体的核酸序列，以利用核苷酸序列在多个细胞中的频率来预测或建模其产生的蛋白的行为或所得的表型。本文的方法、装置和试剂盒是涉及这些和类似的功用。

发明概要

用于筛选产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的单细胞的方法、装置和试剂盒，所述生物活性剂诸如蛋白、核酸、或蛋白和编码其的核酸。

在实践本发明的方法时，将产生一种或多种感兴趣的生物活性剂的细胞分离到单独孔中。允许细胞在孔中产生一种或多种生物活性剂，然后将孔中的一种或多种生物活性剂与结合到固体表面的一种或多种结合剂接触。结合剂特异性地结合孔中的一种或多种感兴趣的生物活性剂，然后基于一种或多种感兴趣的生物活性剂与结合剂或与靶结合蛋白的结合确定关于孔中细胞的信息，例如，关于孔中细胞的信号转导途径是活性还是失活的信息。然后将此信息与固体表面的特定寻址区关联从而鉴定特别感兴趣的孔。在本发明一些方面中，向孔提供生物活性剂，从而影响孔中细胞的状态和/或活性。

在本发明一些方面中，该方法还包括获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列，并将关于感兴趣的生物活性剂的结合性质的信息与编码感兴趣的生物活性剂核苷酸序列关联，所述生物活性剂例如构成感兴趣的蛋白的一种或多种多肽。

在本发明一些方面中，仅获得编码至少一种感兴趣的生物活性剂的核苷酸序列。在这些方面，将产生至少一种感兴趣的生物活性剂的细胞分离到单独孔中，并获得编码一种或多种生物活性剂的核苷酸序列。然后这种数据可用于获得关于感兴趣的生物活性剂的元数据，例如生物活性剂的结合性质、或感兴趣的生物活性剂在被筛选的细胞群中的出现(represented)频率。

因此，本发明提供单独地分析大量细胞的有效方法，而不是分析细胞群体并报告群体的平均测量值。将细胞分离到小微孔中并在其中加工，其中阻滞或封闭了分子在各微孔之间扩散。另外，由于其小的尺寸，每个微孔促进快速反应速率，诸如mRNA杂交或捕获蛋白。而且，捕获到固体基质上的蛋白形成基质上的阵列，其中可一同分析蛋白对固体基质接触的动力学性质，或蛋白与所有捕获的蛋白或复合体共同的标记的亲和配体接触时的动力学性质。

在阅读如下更详细描述的本发明方法和实施方案的细节后，本发明的这些和其它目标、优点和特征对于本领域技术人员将变得明显。

附图简述

结合附图阅读时，最佳地从以下详述理解本发明。重点是，根据一般实践，附图的各个特征不是按比例的。相反，为了清楚，各特征的尺寸是任意放大或缩小的。附图中包括以下图示：

图1是微孔中捕获的B细胞或浆细胞的示意图。

图2是可连同本发明的多孔系统使用的方法的流程图。

图3是mRNA捕获和随后转化为标签cDNA的示意图。

图4描绘用于从抗体-产生细胞捕获mRNA的2种寡核苷酸探针的特征，一种探针是针对小鼠重链(上图)(SEQ ID NO：1)，一种探针是针对小鼠轻链(下图)(SEQ ID NO：2)。401和406是用于被核酸内切酶XhoI从微阵列裂解下合成的cDNA的识别位点。402和406是将用于PCR扩增的引物序列。403和408是增强PCR引物与包含由多个N表示的纠错汉明码的独特14-核苷酸标签(404和409)之间的区分的界标二核苷酸。405是与包括同种型1、2a和2b的小鼠重链mRNA恒定区互补的寡核苷酸(oligo)。此外，410是与小鼠κ轻链mRNA互补的寡核苷酸。为了更好的捕获效率，有间隔子和6个脱氧腺苷残基使得捕获寡核苷酸远离微阵列表面。

图5是可与本发明系统一起使用的多孔托盘部件(1)的一种实施方案的图解视图。孔包括沿着行的索引或地址1-12(2)和沿着列的索引或地址A-H(3)，形成常规96孔托盘。