[发明专利]木糖还原酶的改造和木糖醇脱氢酶与木酮糖激酶的过表达促进耐热酵母菌多形汉逊酵母中的木糖乙醇发酵

说明书

优先权和通过引用并入

本申请要求在2008年5月30日递交的美国临时申请第61/057,515号的优先权，该临时申请包括其中所引用的所有参考文献(在本文重复)通过引用以其整体并入，以达到此类参考文献帮助理解本发明或帮助获得可促进本发明的实施的物质和方法的程度。如果所引用的参考文献的内容与本申请的教导冲突，那么应以本申请为准来理解。

技术领域

本申请涉及通过发酵进行纤维素乙醇生产的领域，具体涉及包括木糖的来源的发酵，更具体涉及用于通过木糖发酵进行乙醇生产的重组多形汉逊酵母(H.polymorpha)菌株，且还更具体涉及过表达具有改变的NADPH亲和力的突变多形汉逊酵母木糖还原酶、以及内生的或重组的木糖脱氢酶和木酮糖激酶的多形汉逊酵母菌株，所述菌株通过在包含木糖的培养基上发酵获得提高的乙醇生产量。

背景

从木质纤维素生产乙醇是化石燃料的环境友好型的可选方案。由于大部分的木质纤维素材料由木糖组成，有必要将木糖有效地发酵成乙醇使得工艺具有成本效益[1]。

一些酵母菌、丝状真菌和细菌能够将木糖转化成乙醇。首先，酵母菌和大部分其他真菌使用优先将NADPH作为辅酶的木糖还原酶EC 1.1.1.21(XR)将木糖还原成木糖醇。然后，其用严格依赖NAD的木糖醇脱氢酶EC 1.1.1.9(XDH)将木糖醇氧化成木酮糖[2]。辅因子特异性的区别导致氧化还原失衡，该氧化还原失衡导致乙醇生产量减少和木糖醇堆积[3，4，5，6，7，8]。已通过代谢改造减少木糖醇生产量，该代谢改造旨在优化XR和XDH的表达水平[9，10，11，12]，将XR的辅因子特异性从NADPH改变为NADH[13，13a]，或修饰宿主细胞的氧化还原代谢[14，15，16]。在木糖发酵期间避开氧化还原失衡所使用的其他方法是基于真菌或细菌木糖异构酶EC5.3.1.5(XI)的表达，该木糖异构酶将木糖直接转化成木酮糖且不需要氧化还原辅因子[17，18]。

木酮糖激酶EC 2.7.1.17(XK)(木糖代谢中的第三酶)的另外的过表达已显示提高在携带XR-XDH-及XI的菌株中的需氧和厌氧木糖利用[12，19]，该木酮糖激酶将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸进入戊糖磷酸途径，且然后进入中间代谢。需要XK的过表达以克服该酶天然低的表达水平[3，5]。过表达导致木糖更有效地转化成乙醇[5，20]。

耐热甲基营养酵母菌多形汉逊酵母能够在提高的温度下(45℃-48℃)进行乙醇发酵[21，22，23]。多形汉逊酵母的这个性质使其成为用于有效的同时糖化和发酵过程(SSF)中的有力候选者。SSF结合木质纤维素物质的酶水解与随后在同一容器中释放的糖的发酵。开发使用多形汉逊酵母从纤维素物质中进行乙醇生产的实用性的主要优势是：该酵母菌具有(i)良好地开发的分子遗传学方法和(ii)模型菌株CBS4732的整个基因组序列的可用性[24，25]。

概述

本公开内容描述了重组多形汉逊酵母菌株的构建，该重组多形汉逊酵母菌株过表达修饰的XR(K341R N343D)和在Δxyl1背景上的天然XDH和XK。示出了菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生产量与过表达天然XR、XDH和XK的菌株的木糖消耗、乙醇和木糖醇生产量的对比，用于对比以证实：当多形汉逊酵母菌株在包含木糖的培养基上生长时，改变的XR酶的过表达提高乙醇产量。本文还公开了相关的重组核酸、突变酶和使用其在木糖上进行乙醇发酵的方法。

附图描述

图1，本公开内容使用的质粒的线性设计：pX1M-Z、pX1N-Z、pX1M-Z-X2、pX1N-Z-X2和pGLG61/HpXYL3。表达盒prGAP-XYL1-trAOX、prGAP-XYL2-trXYL2和prGAP-XYL3-trAOX分别用白框、灰框和加点框示出。修饰型XYL1 ORF用黑框示出。Zeocin抗性基因(Zeo^r)和遗传霉素抗性基因(APH)用阴影线指出，其被连接到编码甘油醛磷酸脱氢酶(GAP)的受损的组成型基因启动子。作为自主复制序列的多形汉逊酵母LEU2基因和端粒区(TEL 188)[29]用交叉阴影线示出。复制起点ORI和氨苄青霉素抗性基因(bla)-以箭头示出。限制位点：P，PstI；H，HindIII；S，SacI；S1，SalI；B，BamHI；ScII，SacII；Xb，XbaI；RI，EcoRI；NdI，NdeI；N，NotI。

图2，来自利用木糖的多个酵母菌的XR辅因子结合位点序列与多形汉逊酵母XYL1序列的比对。保守序列用粗体示出。加下划线的氨基酸被改变(K→R和N→D)。