[发明专利]用于病毒检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在含病毒或病毒来源介质中病毒或病毒抗原的检测和定量化，特别地涉及在疫苗制造和工艺开发中病毒抗原浓度的确定。

背景技术

流感病毒一般基于它们的核蛋白质和基质蛋白质抗原之间的抗原区别分为三个类型A、B和C。流感A病毒以两个主要表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)(其表现为在病毒体的表面上的刺突)为基础进一步分为亚型。

宿主细胞的感染以病毒HA与细胞上的唾液酸结构(sialic structure)的结合开始，使病毒颗粒粘附到细胞表面并且引起病毒摄取。RNA和病毒蛋白质被复制并且组合成新病毒颗粒，其从细胞芽生。子代病毒颗粒通过在病毒上的酶NA分裂末端唾液酸残基(terminal sialic residue)而从细胞表面释放。

当前，有15个不同的HA亚型(H1-H15)和9个不同的NA亚型(N1-N9)。流感A病毒的亚型根据它们的HA和NA表面蛋白质命名，例如H1N1、H1N2、H3N2、H5N1。流感B病毒和流感A的亚型进一步表征为菌株(strain)，例如B Malaysia、H3N2 Heijing、H1N1 Taiwan。

HA和NA都携带抗原决定基(antigenic epitope)。提出的预防HA和NA的抗体减小人和动物中传染或疾病的风险。尽管第一个流感疫苗包含灭活或杀死的整体病毒颗粒，商业上可用的流感疫苗通常是两种类型，“裂解疫苗”和“亚单位疫苗”。

裂解疫苗通过采用乙醚或洗涤剂的纯化病毒颗粒的裂变(disintegration)并且然后洗涤剂与大块病毒脂质材料的去除来制备。裂解疫苗由此基本包含与整体病毒疫苗相同的成分并且处于相同的比例。在另一方面，在亚单位疫苗中，表面糖蛋白HA和NA分别纯化然后组合成疫苗。

流感病毒可以采用两个不同的方式改变，通过“抗原性漂移”和通过“抗原性转换”。抗原性漂移产生可能不被身体的免疫系统认出的新病毒菌株，而抗原性转换是流感A病毒中的突然重大变化，导致新血凝素和神经氨酸酶蛋白质并且产生新流感A亚型。在大多数年份中，流感疫苗中的三个病毒菌株中的一个或两个被更新以跟上正传播的流感病毒的变化。

流感病毒通常是多价的(multivalent、polyvalent)，即，疫苗从相同种类的病毒的一个或多个菌株的培养来制备。当前，流感A/H1N1、A/H3N2和流感B菌株典型地包括在每年的流感疫苗中。

疫苗预防流感的效力主要由免疫原HA在疫苗中的量决定。疫苗中的HA浓度典型地通过单径向免疫扩散(SRID)测定确定。在SRID中，流感病毒粒子由洗涤剂破裂，并且跟从整个病毒或纯化病毒抗原扩散进入包含特定抗血凝素(抗HA)抗体的琼脂糖凝胶中。该所得的抗原/抗体反应或区域(通过染色可见)直接与在制备中的HA抗原的数量成比例。然而，SRID测定具有许多缺点。除具有高检测极限(大约20μg/ml)与高变动(大约10％)外，它是费力的并且具有低处理能力。尽管存在它的短处，然而，SRID仍然是由欧洲药典和WHO推荐并且由流感疫苗评价的监管机构批准的方法。由于该方法差的精确度，疫苗剂量通常由制造商“过量灌装”。

用于流感病毒定量化的其他方法包括反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。

并且基于生物传感器的方法已经开发用于包括流感病毒的病毒的检测。

EP0276142 A1公开用于在涂敷金的衍射光栅上使用表面等离子体振子共振(SPR)检测流感A病毒的方法。对于流感A病毒的分离决定子(determinant)的单克隆抗体固定在金表面上，并且施加并且培养病毒。对于流感A病毒决定子的单克隆抗体然后用该表面培养，并且当第二抗体结合到流感病毒颗粒时获得的增强响应被检测。

JP3054467A公开通过压电振动器测量病毒浓度，其中压电振动器的电极涂有对病毒的表面抗原的抗体。当抗原结合到电极时，振动器的振动频率变得更低。

Shofield，D.J.和Dimmock，N.J.，J.Virol.Methods 62(1996)33-42公开用于流感病毒检测的SPR生物传感器仪器的使用。用于捕获流感病毒的单克隆抗体偶联于涂有羧化葡聚糖的传感器芯片。流感病毒然后注入仪器流动系统以接触该传感器芯片，并且监测与固定抗体的结合亲和力。