[发明专利]通过RNA干扰引入复能基因而重编程细胞

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请是2006年8月1日提交的美国专利中请第11/497,064号的部分继续申请，它根据35U.S.C.§119(e)要求2005年8月1日提交的美国临时申请60/704,465的权益，并且还根据35U.S.C.§119(e)要求以下的权益：2008年4月7日提交的美国临时申请61/042,890；2008年4月7日提交的美国临时申请61/043,066；2008年4月7日提交的美国临时申请61/042,995；以及2008年11月12日提交的美国临时申请61/113,971，它们的每一个均通过引用如同整体描述一样并入本文。

发明领域

本发明的实施方案涉及细胞生物学、干细胞、细胞分化、体细胞核转移和基于细胞的治疗法的领域。更具体地，本发明的实施方案涉及用于重编程细胞的方法、组合物和试剂盒以及基于细胞的治疗法。

发明背景

再生医学作为许多人疾病的治疗极具潜力，但是还伴随着现代科学研究中遇到的一些最困难的技术挑战。再生医学的技术挑战包括低克隆效率、可能的复能(pluripotent)组织供应不足和对于如何控制细胞分化和哪种类型的胚胎干细胞可用于选择的治疗的知识的普遍缺乏。尽管ES细胞具有极大的可塑性，但是未分化的ES细胞可以形成含有混合组织类型的畸胎瘤(良性肿瘤)。此外，从一种来源向另一来源移植ES细胞将需要施用药物来防止新细胞的排斥。

已经进行了尝试来鉴定由非胎儿来源的组织产生干细胞的新途径。一种方法包括自体的成体干细胞的处理。使用自体的成体干细胞用于再生医学的优点在于以下事实：它们来源并返回同一患者，并且因此不会经受免疫介导的排斥。缺点是这些细胞缺乏ES细胞的可塑性和复能性并且因此它们的潜能是不确定的。另一方法着眼于将来自成体组织的体细胞重编程以产生复能ES样细胞。然而，这种方法是困难的，因为多细胞生物体中的每种细胞类型具有独特的表观遗传学标记，认为该标记在细胞分化之后或从细胞周期退出之后是固定的。

细胞DNA一般以染色质的形式存在，染色质是包含核酸和蛋白质的复合体。事实上，大部分的细胞RNA分子还以核蛋白复合体的形式存在。如本领域的那些技术人员已知的，染色质的核蛋白结构已成为广泛的研究课题。一般而言，染色体DNA被包装成核小体。核小体包含核心和连接区。核小体核心包含核心组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3和H4各两个)，约150个碱基对的染色体DNA缠绕在该八聚体周围。此外，约50个碱基对的连接区DNA区段与连接区组蛋白H1缔合。核小体被组织成更高阶的染色质纤维并且染色质纤维被组织成染色体。参见，例如，Wolffe″Chromatin：Structure and Function(染色质：结构和功能)″3.sup.rd Ed.，Academic Press，San Diego，1998。

染色质的结构不是静止的，而是经受着统称为染色质重建的过程的修饰。染色质重建可以用于：例如，从DNA区清除核小体；将核小体从一个DNA区移到另一个DNA区；改变核小体之间的间距；或添加核小体到染色体中的DNA区。染色质重建还可以导致更高阶结构的改变，从而影响转录活性的染色质(开放染色质(open chromatin)或常染色质)与无转录活性的染色质(闭合染色质(closed chromatin)或异染色质)之间的平衡。

染色体蛋白经受了大量类型的化学修饰。这些核心组蛋白的转录后修饰的一种机制是高度保守的碱性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的可逆乙酰化。组蛋白乙酰化的稳态是由竞争性的组蛋白乙酰基转移酶与组蛋白脱乙酰酶之间的动态平衡建立的，组蛋白脱乙酰酶在本文称为HDAC。早已将组蛋白乙酰化与脱乙酰化与转录控制联系起来。可逆的组蛋白乙酰化可以导致染色质重建并且如此可以作为基因转录的控制机制起作用。一般而言，组蛋白的高度乙酰化有利于基因表达，而组蛋白脱乙酰化则与转录抑制相关联。据显示组蛋白乙酰基转移酶充当转录辅激活蛋白，而脱乙酰酶则被发现是属于转录抑制途径的。

组蛋白乙酰化与脱乙酰化之间的动态平衡是正常细胞生长所需的。组蛋白脱乙酰化的抑制导致细胞周期停滞、细胞分化、凋亡和转化的表型逆转。