[发明专利]乙酰肝素酶缺陷的非人类哺乳动物

说明书

技术领域

本发明与至少拥有一个受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段的细胞和非人类哺乳动物有关。本发明还与使用乙酰肝素酶(Hpse)缺陷的非人类哺乳动物进行医疗药品筛选有关。

背景技术

乙酰肝素酶是一种哺乳动物体内产生的β-糖苷降解酶，专门用于降解肝素和硫酸乙酰肝素(HS)蛋白多糖，因此与细胞表面和细胞外基质功能有密切联系。乙酰肝素酶活动与肿瘤细胞的转移有关，因为乙酰肝素酶降解细胞间质(ECM)的HS，从而导致ECM的结构改变，因而促进肿瘤细胞的转移。与之类似，乙酰肝素酶活动与血管形成、炎症和自身免疫有关，参与血管内皮细胞的活动和免疫细胞的激活及运动。现有结果确定，乙酰肝素酶表达量与肿瘤血管生成和癌症病人的存活率有关。

尽管之前有关于多种哺乳动物肝素/HS降解内切酶(endoglycosidase)的报道，目前研究的结果显示哺乳动物细胞只表达一个具有活性的乙酰肝素酶(Hulett等，Nat med.，1999，5：803-809；Vlodavsky等，Nat Med.，1999，5：793-802)。

由于乙酰肝素酶在哺乳动物体内从生理学功能(包括胚胎形成和发育)到多种疾病(如炎性反应，血管再生和肿瘤转移)等基础生物现象中扮演了重要的角色，因此需要一个动物模型对乙酰肝素酶进行活体研究。美国专利公报US2002/0194625表明转基因鼠表达人类乙酰肝素酶用于研究肿瘤发生和病理过程。国际专利公报WO2004/006949表明使用乙酰肝素酶表达转基因鼠作为模型来测试乙酰肝素酶在毛发生长中多个方面的角色。

由于乙酰肝素酶的重要性和多功能性，缺乏乙酰肝素酶的动物可以作为有价值的工具来展现乙酰肝素酶所扮演的角色。尽管在这方面的需求得到广泛认同，并有多次尝试建立乙酰肝素酶缺陷的动物，但是到目前为止这种动物还不存在。国际专利公报WO2005/118808表明利用小干扰RNA(siRNA)技术可以抑制细胞中的乙酰肝素酶活性。然而很不幸，siRNA技术不适用于创造稳定的无乙酰肝素酶动物或者完全抑制乙酰肝素酶活性的模型。

所以对乙酰肝素酶缺陷的动物仍然有需求。

发明内容

本发明提供一个至少拥有一个受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段的转基因非人哺乳动物。在一个实例中，受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段缺乏促进子和外显子1。更确切的说，受干扰的乙酰肝素酶基因可能会缺少HindIII-Xbal片段。此发明包括受到干扰的杂合子或纯合子哺乳动物。

本发明还提供从上述非人类转基因哺乳动物中得到的细胞。

另外，本发明提供了一种制作至少有一个受干扰乙酰肝素酶等位基因片段的转基因非人类哺乳动物的方法，该方法包括在非人类哺乳动物胚胎干细胞中使用同源组合来敲除乙酰肝素酶基因的步骤；将得到的含有重组细基因的胞植入从动物体内分离的胚泡中；将胚泡移植到假孕的非人类哺乳动物；移植的胚泡发育成为一个转基因非人类哺乳动物；交配产生转基因非人类哺乳动物以繁殖后代；在后代中检测到拥有至少一个被干扰乙酰肝素酶等位基因片段的非人类哺乳动物。在一个特定的实例中，乙酰肝素酶基因被删除部分包括SEQ ID NO：1中的核酸序列。

本发明还提供包含一个用于构建乙酰肝素酶核酸序列载体的质粒，在此载体中至少一部分的乙酰肝素酶外显子序列被所选定的标记核酸序列所替代。在一个实例中，选定的标记序列包含一个抗新霉素基因。

另外，本发明提供一个筛选药品的模型，包含用至少拥有一个受到干扰的乙酰肝素酶等位基因片段转基因非人类哺乳动物的步骤；如对上述的哺乳动物诱导疾病；然后在该动物上筛选药品；从而通过该动物疾病的发展分析药物的作用。在一个实例中，给动物接种肿瘤细胞或刺激造成炎症。上述的分析包括确定是否形成肿瘤转移或炎症反应程度。在其它实例中，上述的疾病诱导包括实验性自身免疫脑脊髓炎。在其他一些实例中，上述的疾病诱导剂可引起过敏反应。方法包括将结果与在其它非转基因非人类哺乳动物上实验的结果进行比较。

附图说明

本发明将根据实例和附带的数据进一步的详述。

图1A显示设计的乙酰肝素酶基因(Hpse)5’端的(指定为正常等位基因片段)和被干扰的目标片段(指定为K/O等位片段)。同源组合造成第1外显子和促进子的消失并被替换为一个neo基因。显示了在限制酶Sca I或者ERv处理后的基因片段数量。编号1～4的片段代表了可用于DNA印迹检测的探针。Neo的编码方向有所显示。