[发明专利]结合蛋白体内半衰期的体外估测

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年4月18日提交的美国临时申请系列号61/046,062的优先权，其内容并入本文。

技术领域

本发明概况地涉及结合蛋白。具体地，本发明提供了用于估测治疗性结合蛋白的体内半衰期的体外方法。

背景技术

治疗剂在受试者的循环中的持续时间取决于多种因素。典型地，将任意药剂在循环系统中的持久性表征为可量化的药代动力学值，诸如半衰期(t_1/2)。根据具体的药剂，可能影响它的半衰期的一些更明显的因素包括、但不限于：药剂对不同的血浆或肝降解活性(例如，蛋白水解活性、糖酵解活性)的敏感性、药剂在血液中的溶解度、药剂的免疫原性、肝的滤出药剂的能力和它的结合一种或更多种血清结合蛋白(例如，血清白蛋白)的能力。

对于许多候选治疗剂，在确定这样的候选分子是否可以开发成有效的治疗剂时，药代动力学半衰期非常重要。因而，无论在高通量筛选计划中候选分子表现得对目标靶物如何有活性，如果它缺少允许该分子在受试者的循环中持续足够长以达到适当稳态浓度从而提供希望的治疗益处的体内半衰期，这样的分子可能实际上几乎不具有治疗价值。因此，在候选治疗剂的筛选过程中的某个时刻，必须评估每种有希望的候选分子的药代动力学体内半衰期的指征，以便从该过程排除具有不希望的体内半衰期的那些分子。

典型地，使用诸如大鼠或小鼠等小哺乳动物，得到候选分子是否具有可接受的体内半衰期的首要指征。无论这样的小哺乳动物体内半衰期研究可能有怎样的价值，但是，这样的程序将大量的人力、时间和费用消耗在筛选过程上。显然，如果在药物开发过程中可以使用可靠的且简单的体外方法来测定候选分子是否具有保证它们的持续包含的药代动力学体内半衰期，会使新治疗剂的筛选过程更有效且更经济。

发明内容

本发明提供了简单的、有效的且可靠的估测结合蛋白的体内半衰期的体外方法。在一个方面，本发明的结合蛋白包含治疗性结合蛋白。在另一个方面，本发明的结合蛋白包含参照结合蛋白。在一个具体的方面，本发明提供了估测结合蛋白的体内药代动力学半衰期(t_1/2)的体外方法，所述结合蛋白具有一个或更多个免疫球蛋白(Ig)折叠。所述方法可容易地适应自动化的和机器人的（robotic）高通量筛选程序，允许以有效且省时的方式估测多种结合蛋白的体内半衰期。因此，所述方法特别适用于筛选和开发新的治疗性结合蛋白（例如针对治疗靶标的不同抗体构建体）的程序。

本发明的一个实施方案涉及估测目标结合蛋白的体内半衰期，其包含下述步骤:

(a) 使用体外蛋白酶反应试验，测定目标结合蛋白和至少2种不同参照结合蛋白中的每一种的体外半衰期，其中所述参照结合蛋白具有已知的不同的体内半衰期，

(b) 确定每种参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，

(c) 从所述参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关联的目标结合蛋白的体内半衰期。

在一个方面，结合蛋白的体内半衰期是指在人中的半衰期。其它动物物种，包括脊椎动物和无脊椎动物物种，也适用于本发明。示例性的物种包括、但不限于：哺乳动物、鸟纲（aves）、pices、爬行动物和两栖动物。

在一个方面，目标结合蛋白是治疗剂。在一个具体方面，目标结合蛋白具有一个或更多个Ig折叠。

可以将通过蛋白水解反应试验测得的每种参照结合蛋白的已知体内半衰期和它们各自的体外蛋白水解半衰期之间的关系绘图，例如，通过相对于测得的每种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期绘制已知体内半衰期，得到参照图(标准曲线)。这样的标准曲线也可以计算得到，无需制作数据的实际图表。

许多合适的蛋白酶或蛋白酶组合可以用于本文所述的估测结合蛋白(例如，目标结合蛋白)的体内半衰期的体外蛋白酶试验中。合适的蛋白酶的实例包括、但不限于：嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及其组合。

本文使用的参照结合蛋白通常结合已知的同源配体，并具有已知值的体内半衰期，例如，在人中的半衰期。在一个方面，参照结合蛋白包含一个或更多个Ig折叠。这样的参照结合蛋白的实例是具有例如一个或更多个Ig折叠的已知的治疗性抗体分子以及其它已知的治疗性结合蛋白。

在一个实施方案中，本文提供的估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法是，通过在蛋白水解反应试验中测定体外半衰期，然后根据线性公式计算估测的体内半衰期: