[发明专利]在细胞培养中增加活力和生产率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及增加分批补料真核细胞培养中的活力和分泌蛋白质产生的方法。

背景技术

哺乳动物细胞培养由于其能够产生具有适当的翻译后修饰的蛋白质而成为许多重组蛋白生产工艺的首选系统。随着生产需求的增加，存在强大的动机通过增加产物收率来提高工艺效率。在商业生产工艺中获得每升几克的生物治疗药物的生产水平取决于同时使哺乳动物细胞培养和基因工程方法优化。

目前的高密度、无蛋白质的哺乳动物细胞培养中固有的是细胞死亡的问题，其中细胞凋亡在典型的分批补料生物反应器中占细胞死亡可高达80％，其在响应于应激源例如营养和生长因子消耗、氧耗尽、毒素积聚以及剪切应力时被诱导(Goswami等人，Biotechnol.Bioeng.62：632-640(1999))。细胞凋亡限制了最大活细胞密度，加速了死亡阶段的起始以及潜在地减少了异源蛋白的产量(Chiang和Sisk，Biotechnol.Bioeng.91：779-792(2005)；Figueroa等人，Biotechnol.Bioeng.73：211-222(2001)，Metab.Eng.5：230-245(2003)，Biotechnol Bioeng.85：589-600(2004)；Mercille和Massie，Biotechnol.Bioeng.44：1140-1154(1994))。

细胞凋亡是信号通路的复杂网络造成的结果，该信号通路的复杂网络起始于细胞内部和外部，最后激活半胱天冬酶，执行细胞死亡的最后阶段。已经使用各种防止细胞凋亡的方法来维持哺乳细胞培养中在延长的生产运行期间的细胞活性(Arden和Betenbaugh，Trends Biotechnol.22：174-180(2004)；Vives等人，Metab.Eng.5：124-132(2003))。通过向培养基中补充生长因子、水解产物和限制性营养物质来改变胞外环境已经导致蛋白产量的增加和细胞凋亡的减少(Burteau等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.39：291-296(2003)；Zhang和Robinson，Cytotechnology 48：59-74(2005))。其他研究者已经转向化学和遗传策略来抑制凋亡信号级联进入细胞(Sauerwald等人，Biotechnol.Bioeng.77：704-716(2002)；Biotechnol.Bioeng.81：329-340(2003))。研究者已经发现在癌症细胞中出现上调的基因的过表达能通过阻止半胱天冬酶活化上游的细胞凋亡来延长在生物反应器中生长的细胞的活性(Goswami等人，同上；Mastrangelo等人，Trends Biotechnol.16：88-95(1998)；Meents等人，Biotechnol.Bioeng.80：706-716(2002)；Tey等人，JBiotechnol.79：147-159(2000)和Biotechnol.Bioeng.68：31-43(2000))。

在线粒体凋亡通路中行使功能的抗凋亡基因可分成三组，即1)在通路早期起作用的基因，例如Bcl-2蛋白质家族的成员；2)在通路中期起作用以破坏或抑制凋亡复合体的基因，例如Aven以及3)在通路晚期起作用的基因，例如半胱天冬酶抑制剂XIAP。大多数这些基因的功能已通过在哺乳动物表达系统中过表达进行了研究，在一些情况下，还测定了两个或更多个基因共同过表达的效果，其中每个基因来自通路的不同部分。例子包括1)CHO细胞中Bcl-XL和XIAP的缺失突变体(XIAPΔ)的加性效应(Figueroa等人，Metab.Eng.5：230-245(2003))；2)BHK细胞中的E1B-19K和Aven(Nivitchanyong等人，Biotechnol Bioeng.98：825-841(2007))和3)Bcl-XL、Aven和XIAPΔ(Sauerwald等人，Biotechnol.Bioeng.81：329-340(2003))。