[发明专利]单分子实时测序装置、核酸分析装置和单分子实时测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸序列解析方法和核酸序列解析装置。更具体而言，涉及用于解读例如DNA或RNA等核酸的碱基序列的方法和装置。

背景技术

1990年至2005年间，投入30亿美元预算的人类基因组计划已经比预定提前2～3年读取出最容易解读的部分(全体的93％)，正如非专利文献1所述，解读所必需的技术和方法已经作为一种遗产保留下来。这一技术在之后不断进行改进，时至今日，用约2000万美元($2×10⁷)左右已经能够以实用的精度解读基因组。即便如此，能用该金额实现大规模碱基序列解读的仍仅限于专门解读中心或获得巨额预算的大型研究计划。但是，若能够降低序列测定成本，则大多能够处理更大量的基因组。例如使患者和健康人群的基因组的比较成为可能，从而能期待基因组信息价值的提高。如非专利文献2所示，预计这类基础数据的取得将大大有助于未来向定制(tailor made)医疗的发展。

上述现状下，美国国立卫生研究所(NIH)出资援助的用于“革新的基因组序列测定技术”的2个计划的目标是，至2009年解读1个人的人类基因组降至10万美元($1×10⁵)，并且使其在2014年前降至1000美元($1×10³)。正在开发“1000美元基因组”解读技术。

如非专利文献3所述，目前几种新一代序列分析仪已经商品化。这些技术已能实现现有技术的1/10～1/100的成本。此外，通过1次解析能测定的碱基数也达到10⁹级。然而，这些序列分析仪在成本方面的改善基本上达到极限，预计很难利用已商品化的装置、方式实现$1000基因组。

此外，目前销售的新一代序列分析仪虽能解读直至10⁹左右的碱基序列，但是，仅是对10⁹左右的大量数据进行序列解读的运行时间(run time)就需要2、3天以上的时间。为了在医疗现场使个人水平的基因组序列解读成为日常工作，则不仅是成本方面的改良，还需要序列解读的高速化。

这种状况下，备受期待的最有希望的测序技术之一是单分子实时测序法。其为对酶反应的现场直接以单分子水平进行实时测定的方法。单分子实时测序法中，在碱基进行延伸时实时进行荧光检测。因此，能够飞速进行碱基序列解读。此外，单分子实时测序法中，无需利用PCR对试样进行扩增，能大幅降低成本。因此，单分子实时测序法被视为最有希望实现1000美元基因组的技术之一。

非专利文献4中公开了一种单分子实时测序法。该文献中采用的方法为：将用供体荧光体修饰过的聚合酶固定在基板上，随着核酸的延伸反应，荧光能量向受体-核苷酸转移，对该荧光能量转移进行测量。

此外，作为控制在细胞内进行的各种生化过程、进行实时解析的技术，可列举出笼锁化合物。笼锁化合物是将生理活性分子用光分解性保护基修饰使其暂时失去活性的物质的总称。按照使生理活性进入笼(cage)中并休眠的分子这一意思而命名为笼锁化合物(caged compounds)。当对笼锁化合物照射最适合该化合物的波长的光时，在被光照的瞬间、仅在被照射的地方保护基脱除，从而表现原有的生理活性。即，能通过光照控制化学反应的时间、空间动力学。专利文献1、2中为制备寡核苷酸池而使用了笼锁化合物。但该方法是使用逐次反应、使末端所结合的笼锁化合物随着反应而依次分解的方法。因此，该方法无法用于实时解析。此外，该方法的对象是多分子而非单分子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2006-503586

专利文献2：US 2007/0059692

非专利文献

非专利文献1：Nature Reviews(自然评论)，vol5，pp335，2004

非专利文献2：《ヒトゲノム完全解読から「ヒト」理解ヘ》(从人类基因组完全解读到理解“人类”)、pp253，服部正平、东洋书店、2005

非专利文献3：Nature(自然)，voll.449，pp627，2007

非专利文献4：《Next-Generateion Sequencing：Scientific and Commercial Implications of the $1,000 Genome》(新一代测序技术：$1,000基因组的科学和商业上的关联)，Kevin Davies，pp41，Insight Pharma Reports

非专利文献5：Anal.Chem.vol.78，6238-6245