[发明专利]核酸扩增的对照的检测方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及检测对检测体核酸的标的序列进行扩增时显示反应体系的扩增性能的对照的方法及其用途。具体而言，涉及使用上述对照的检测方法的核酸扩增方法和解链曲线分析方法，以及使用这些方法的对照检测用试剂。

背景技术

近年来，在基因分析中，分析由标的序列和探针形成的双链核酸的解链温度(Tm：melting temperature)的方法正在被实用化。由于该方法通过例如Tm分析或者上述双链的解链曲线分析而进行，因此也称为解链曲线分析。根据该方法，能够检测例如标的序列的扩增的有无、上述标的序列内的目的多态性。

上述扩增的有无，例如，能够如下操作而检测。首先，在能够与上述标的序列杂交的引物的存在下，对检测体核酸中的上述标的序列进行扩增，之后，使上述标的序列的扩增产物与上述引物杂交。然后，对上述杂交形成体实施加热处理，将伴随温度上升的杂交的解离(解链)作为吸光度等信号值检出，测定显示较大的信号变动的Tm值(测定值)。另外，对上述标的序列和上述引物的杂交形成体，预先求出Tm值(评价基准值)。这样，如果测定值与评价基准值为同等程度，则能够判断上述标的序列发生了扩增，不能测定Tm值时，能够判断上述标的序列没有进行扩增。另外，多态性能够例如如下操作而检测。首先，在能够与目的标的部位为突变型的标的序列杂交的探针的存在下，对检测体核酸中的标的序列进行扩增，与上述同样地操作，由信号变动的检测而测定Tm值。Tm值随着杂交形成体的互补性的增高而增高，随着互补性的降低而降低。因此，对上述标的部位为突变型的标的序列和上述引物的杂交形成体预先求出Tm值(评价基准值)，与上述测定的Tm值进行比较。如果该测定值与评价基准值为同等程度，则匹配，即检测体核酸的标的部位能够判断为突变型，如果测定值低于评价基准值，则不匹配，即检测体核酸的标的部位能够判断为野生型。

在利用这样的解链曲线分析进行基因分析时，在检测体核酸的扩增的检测之外，另外进行阳性对照和阴性对照的检测(参照专利文献1)。上述阳性对照一般是显示反应体系中是否发生扩增反应的对照。上述阴性对照是显示反应体系中是否混入不需要的核酸的对照。首先，从以下理由出发，阳性对照是需要的。在核酸扩增中，当无法检测标的序列的扩增时，不清楚是由于上述检测体核酸中不存在上述标的序列，还是由于反应体系中扩增反应本身没有发生。因此，在用于对检测体核酸进行扩增的检测体用反应体系之外，另外使用阳性对照用的反应体系，同样地进行核酸的扩增和Tm值的分析。上述阳性对照用的反应体系中，除了不添加检测体核酸而添加含有上述标的序列的模板核酸(阳性对照用模板核酸)以外，与上述检测体用反应体系条件相同。其结果，在上述阳性对照用的反应体系中，如果能够确认与评价基准同等程度的Tm值，则为阳性对照(+)，能够判断扩增反应发生。因此，在上述检测体用反应体系中没有检测出扩增时，能够判断在上述检测体核酸中不存在标的序列。另外，在上述阳性对照用反应体系中，如果不能确认Tm值，则为阳性对照(-)，能够判断扩增反应自身没有发生。接着，从以下理由出发，阴性对照是需要的。在反应体系中，例如，例如由于实验者的细胞等混入，混入检测体核酸以外的核酸，其结果，有时存在由上述混入的不需要的核酸发生扩增的情况。这样，则即使以评价基准的Tm值确认信号变动，也不清楚是来自检测体核酸的扩增，还是来自混入的核酸的扩增。因此，在检测体用反应体系和阳性对照用的反应体系外，另外还使用阴性对照用的反应体系，同样地进行核酸的扩增和Tm值的分析。上述阴性对照用的反应液除了不添加检测体核酸以外，与上述检测体用反应体系条件相同。其结果，在阴性对照用的反应体系中，不能确认Tm值时，为阴性对照(+)，判断没有不需要的核酸混入，确认Tm值时，为阴性对照(-)，判断由不需要的核酸的混入而发生了扩增，需要重新再次进行分析。

这样，进行检测体核酸的分析时，在检测体用反应体系之外，必须分别准备一个阳性对照用反应体系和一个阴性对照用的反应体系。但是，分析仪器等中，测定部的个数受限，例如，当上述测定部为4个时，能够同时分析的反应体系的个数为四个，因此，在一次分析中，一半被对照所占据。另外，每次分析需要阳性对照用的反应体系和阴性对照用的反应体系。而且，即使只能进行一个检测体的分析，也必须使用两种对照用的反应体系。这样，对照用的反应体系的数量越多，试剂等的费用也越多。

专利文献1：日本专利第3331178号公报

发明内容

本发明目的在于提供一种在一个反应体系中简便地同时检测显示扩增反应发生的阳性对照和显示不需要的核酸混入反应体系中的阴性对照的对照检测方法。