[发明专利]通过在低pH下发酵生产二羧酸

说明书

发明领域

本发明涉及生产二羧酸的方法。本发明特别涉及通过酵母的发酵来生产二羧酸。

发明背景

二羧酸(例如延胡索酸和琥珀酸)是重要的化合物，其在食品工业中用于食物制备和防腐，在医药工业中用于配制药物制品，以及用于其他工业用途，例如(生物)聚合物的单体。为了满足对二羧酸的日益增加的需要，正在开发更高效和更具成本效益的生产方法。传统上通过发酵能够生产大量二羧酸的细菌来制造二羧酸。这例如描述于US 5,573,931中，其中描述了通过使用细菌菌株生产高浓度的琥珀酸的方法。然而，与用细菌生产二羧酸的用途相关的一个主要的缺点是二羧酸盐的形成。如果使用细菌，则发酵期间的pH需要被维持在pH 6-7的范围内，这高于所有二羧酸的pKa值。因此，大部分酸将以其盐的形式被生产，这些盐必须被转化成酸。在大规模生产方法中这不实用不高效，并且提高生产成本。此外，并非细菌的微生物也已被用于生产有机酸。EP 0 424 384公开了在含有碳酸钙的培养基中通过Rhizopus生产有机酸的需氧方法。EP 1 183 385公开了经遗传操纵的酵母细胞，所述酵母细胞具有Crabtree阴性表型并且含有用于生产乳酸的外源核酸分子。

发明详述

本发明涉及用于生产二羧酸的方法。所述方法包括在低于二羧酸pKa的pH值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧时发酵酵母。本发明的方法提供了二羧酸产物的高产率，允许更简单的下游加工，并且比现有方法更具成本效益，现有方法中生产的是盐，其必须随后被转化成酸。因为二羧酸具有多于一个的pKa值，所以pH应当低于二羧酸的最低pKa。对大部分酸而言，pH应典型地在pH 1.0到pH 5.5的范围内，优选地在pH 2.0和pH 4.0之间。在一个实施方案中，在3.0的pH值下生产琥珀酸。另一优点是由于pH低，所以污染的风险被降低。

酸生产阶段之前优选是针对最优生物质生产的生物质形成阶段。在生物质形成阶段中，pH在pH 2到pH 7的范围内。优选地，pH在pH 3到pH 6的范围内，更优选地，pH在pH 4到pH 5的范围内。

根据本发明的方法更具成本效益，并可导致低30％的成本价格。原因之一是滴定剂成本被显著降低。

本发明的方法可被用于生产任何二羧酸。合适的例子包括己二酸、延胡索酸、衣康酸(itaconic acid)、琥珀酸、苹果酸、草酸。优选地，二羧酸是琥珀酸、延胡索酸或苹果酸。

在本发明方法中使用的酵母可以是任何合适的酵母。酵母的合适例子包括Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia和Yarrowia，例如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyvermoces lactis、Candida sonorensis、Pichia stipidis和Yarrowia lipolytica的物种。在一个实施方案中，本发明方法中使用的真核微生物是Saccharomyces cerevisiae——一种广泛使用的工业上感兴趣的微生物。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的酵母是经遗传修饰的酵母。在本文中使用时，在根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母被定义为下述酵母细胞，其含有所述酵母细胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽，或者经所述酵母细胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰过，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。野生型酵母细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。

优选地，根据本发明的方法中的酵母是经遗传修饰的酵母，其包含编码选自下组的异源酶的核苷酸序列，所述组由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸还原酶和延胡索酸酶组成。异源酶的优选的实施方案如下文定义。

当用于指出给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种、优选地相同品种或株系的宿主细胞或生物生产。

在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语“异源的”表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其被发现于与其天然被发现的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的位点不同的细胞或位点。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或是以合成方式或重组方式生产的。