[发明专利]用于缀合生物分子的新试剂和方法

说明书

本发明涉及用于缀合生物分子特别是蛋白和肽的新试剂和新方法。

许多治疗活性分子例如蛋白不具有实现临床医用效力所需的性质。例如，许多天然蛋白不能形成好的药物，原因是在对患者给药时存在若干固有缺点，包括：(1)蛋白被许多存在于血液或组织中的内源和外源肽酶消化；(2)许多蛋白具有某种程度的免疫原性；以及(3)蛋白可通过肾脏超滤和内吞作用迅速排泄。可能在药物中作为活性治疗剂使用的某些分子具有全身毒性或者缺少最佳生物利用率和药代动力学。当蛋白从血液中迅速清除时，通常不得不频繁地将其给予患者。频繁给药还增加毒性危险，特别是免疫引起的毒性。

水溶性合成聚合物特别是聚亚烷基二醇广泛地用于缀合治疗活性分子例如蛋白、肽和低分子量药物。这些治疗缀合物已被证明可有利地通过延长循环时间和降低清除率来改变药代动力学，降低全身毒性，并且在多种情况下呈现临床效力的提高。将聚乙二醇PEG共价缀合于蛋白的方法通常称为“聚乙二醇化”。

对于使效力最优化并确保剂量与剂量一致重要的是：对于每种分子，每个蛋白缀合的聚合物分子的数量相同；并且每个聚合物分子特异地共价缀合于每个蛋白分子的相同氨基酸残基。在沿蛋白分子的位点上的非特异性缀合可导致缀合产物以及通常非缀合蛋白的分布，从而产生纯化困难且昂贵的复杂混合物。

对于硫醇特异性缀合，通常使用具有一端以马来酰亚胺基团终止的PEG链的聚乙二醇化试剂。许多出版物例如WO 2004/060965描述了这样的试剂。马来酰亚胺终止的试剂可市购获得。然而，许多PEG-马来酰亚胺在贮存和与药物候选物缀合的过程中是水解不稳定的。具体地，在缀合之前和之后均会发生马来酰亚胺环的很大程度的水解。

我们现在已经发现一种类型的聚乙二醇化试剂，所述试剂可用于将包括蛋白和肽的分子经单个亲核残基例如硫醇基团缀合于聚合物，并且所述试剂优于这类市售试剂。

因此，本发明提供一种使含有硫醇或氨基基团的分子缀合于聚合物的方法，该方法包括使所述分子与如下通式的化合物反应：

X-[Q-W-(CH＝CH)_n-(CH₂)₂-L]_m    (I)

其中X代表一个聚合物；Q代表一个连接基团；W代表一个吸电子基团；n代表0或1-4中的一个整数；L代表一个离去基团；m代表1-8中的一个整数。

由本发明方法获得的直接产物通常可由如下通式表示：

X-[Q-W-(CH＝CH)_n-(CH₂)₂-Z]_m    (IIa)

其中X、Q、W、n和m具有上面给出的意义，Z代表通过一个硫醇或氨基基团缀合的所述分子。如果需要，可使所获得的式IIa的化合物转变为任何其他所需的产物。具体地，可使获得的通式IIa的化合物转变为通式II的化合物

X-[Q-W′-(CH＝CH)_n-(CH₂)₂-Z]_m    (II)

其中W′代表一个吸电子部分或一个可通过还原吸电子部分制备的部分。

通式(I)的化合物是新化合物，本发明因此还提供了这些化合物本身。特别优选的式(I)的新化合物是如下定义的式(Ia)的化合物。

通式(II)的化合物式也是新化合物，本发明因此还提供了这些化合物本身。特别优选的式(II)的新化合物是如下定义的式(IIb)的化合物。