[发明专利]生产己二酰基-7-ADCA的菌株

说明书

发明领域

本发明涉及生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株，它们的构建方法，以及鉴定与功能性失活涉及己二酸降解的基因和酶的方法。

发明背景

半合成的β-内酰胺抗生素(SSA’s)从β-内酰胺中间产物开始以工业规模生产，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-ACCA)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-PACA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。

第一代7-ADCA制品衍生自PenG，其中5-元青霉烯环到6-元头孢烯环的扩环和随后苯乙酰基-7-ADCA苯乙酸侧链的切割均使用化学反应进行。下一代7-ADCA制品仍然从PenG获得，但是在化学扩环之后，使用合适的(青霉素)酰基酶酶促切除苯乙酰基-7-ADCA的苯乙酸侧链。已开发出其它方法，其中使用合适的扩环酶体外进行PenG到苯乙酰基-7-ADCA的扩环，但是这些方法仅具有很低的工业重要性。

最近期和最精致的7-ADCA生产方法：包括培养下述Penicillium chrysogenum，所述Penicillium chrysogenum用编码合适扩环酶的基因转化并表达所述基因。该经改造的Penicillium chrysogenum菌株在存在己二酸作为侧链前体时在发酵管中生长时，生产并分泌己二酰基-7-ADCA-见WO93/05158。在该生产过程中，从发酵液中回收己二酰基-7-ADCA，对其进行合适的酰基酶处理，从而切除己二酸侧链，之后进一步纯化、结晶和干燥由此获得的7-ADCA。其它侧链前体已公开于WO95/04148(2-(羧乙基硫代)乙酸和3-(羧甲基硫代)-丙酸)、WO95/04149(2-(羧乙基硫代)丙酸)、WO96/38580(苯乙酸)和WO98/048034和WO98/048035(多种二羧酸)中。扩环酶负责多种N-酰基化青霉烷酸5元环的扩环，从而得到相应的N-酰化去乙酰氧基头孢烷酸。

然而，除了被用作侧链前体以外，己二酸盐可以被降解并在初级代谢中被用作碳源。这由Robin et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2001)57，357-362))在使用蔗糖作为主要碳源的分批培养物中证实。耗尽(源自蔗糖的)葡萄糖和果糖后，开始形成己二酰基-6-APA和己二酰基-7-ADCA，并且在这一阶段中，仅至多2％的己二酸被并入β-内酰胺化合物中，而剩余部分被用作碳源。作者提出，由于己二酸和脂肪酸之间的相似性，己二酸降解很可能通过β-氧化而发生。在较晚的研究中，Thykaer et al.(Metabolic Engineering(2002)，4，151-158)以生产己二酰基-7-ADCA的Penicillium chrysogenum菌株的代谢网络分析为基础得出下述结论：己二酸盐降解通过β-氧化酶发生在微体(乙醛酸循环体)中，而不是胞质溶胶或线粒体中。通常(丝状)真菌和酵母中，特别是Penicillium chrysogenum中，在细胞内定位、涉及的酶以及β-氧化途径在微生物总体代谢中的作用方面，β-氧化途径的本质仍然是不清楚的。

为了减少己二酸降解，Thykaer et al.(2002)已提出缺失负责己二酸盐降解的酶，然而没有将任何此类酶指定为合适的候选者。然而迄今为止，没有提供直接或明确的证据表明己二酸实际上通过β-氧化途径被降解。最有可能地，己二酸的降解还涉及其它降解机制，例如所谓的苯甲酸盐降解途径(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_pathway？org_name＝sma&mapno＝00362)。在所述途径中，3-氧代己二酸盐在两个步骤中被转化成琥珀酰基-CoA和乙酰基-CoA——与Thykaer et al.(2002)的研究鉴定的产物相同。己二酸盐可以被Penicillium chrysogenum的酶很好地氧化，并且通过所述途径将获得的己二酸盐随后转化进中央碳代谢途径。