[发明专利]血浆肾素的质谱分析

说明书

发明领域

本发明涉及肾素活性的测量。在一个具体方面，本发明涉及通过HPLC-质谱法测量血浆肾素活性的方法。

发明背景

下列发明背景的描述只是提供用来辅助理解本发明，并非承认描述或构成本发明的现有技术。

如Fredline等Clin.Chem.45：659-664(1999)所述，肾素是通过肾小球旁细胞分泌到血液中的蛋白水解酶。肾素作用于血管紧张素原，生成被称作血管紧张素1(Ang1)的十肽。Ang1被血管紧张素转换酶进一步切割，形成被称作血管紧张素2(Ang2)的八肽。Ang2刺激细胞生长、钠的肾小管运输和醛固酮释放。Ang2是人最有效的血管加压剂之一，并在血压调控中起重要作用。Ang2由于其循环浓度非常低和半衰期极短而难于直接测量；比Ang2更稳定的Ang1为测量肾素-血管紧张素系统的状态提供了更好的分析物。由Ang1的生成速率确定“血浆肾素活性”(PRA)被临床用于高血压的诊断和控制。

确定PRA的经典方法是放射免疫测定(RIA)，参见Sealey，Clin.Chem.37：1811-1819(1991)；Shionoiri等，Horm Res.37：171-175(1992)。典型的放射免疫测定通过在试管中同时制备一系列标准和未知的混合物而进行，各混合物包含相同浓度的标记抗原和特异性抗体。适当的反应时间后，通过多种技术中之一将标记抗原的抗体结合(B)部分与游离(F)部分分离。将标准品的B/F比作为未标记抗原浓度的函数作图(标准曲线)，且通过将观测到的B/F比与标准曲线进行比较来确定未知的抗原浓度。放射免疫测定法基于竞争性结合原理，且所用的抗体可进行与其它血浆蛋白如内源血管紧张素的非特异性结合。这种潜在的交叉反应性可引起PRA的过高评价。另一个方法是在用RIA定量前利用HPLC从其它血管紧张素中分离Ang1(参见下列实例：Meng等，J.Am.Soc.Nephrol.6：1209-1215(1995)；Meng等，J.Chromatogr.21，614(1)：19-25(1993)；Kohara等，Peptides 12：1135-1141(1991))。已利用紫外光、荧光和质谱检测发展了用于定量Ang1的这些HPLC法(参见下列实例：Klickstein等，Anal Biochem 120：146-150(1982)；Miyazaki等，J Chromatogr.490：43-51(1989)和Fredline等，Clin.Chem.45：659-664(1999))。

例如，Fredline等描述了利用HPLC-电喷雾-串联质谱法进行血浆肾素活性的测量。在进行该测量中，Fredline等在水敏性酶抑制剂(即，苯甲基磺酰氟(PMSF))存在下温育血浆样本，并通过观测具有(m/z)649的前体离子的碰撞诱导解离来测量温育期间生成的血管紧张素1量。

发明概述

本发明提供了通过质谱法测量样本中血管紧张素1的量和测量样本中血浆肾素活性的方法，所述质谱法包括串联质谱法。

一方面，提供测量样本中血管紧张素1的量的方法。该方法可包括：(a)电离样本中的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；(b)通过质谱法检测血管紧张素1离子(一种或更多种)的量，其中该离子选自质/荷比为433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5的离子；以及(c)利用所检测的血管紧张素1离子(一种或更多种)的量来测量样本中血管紧张素1的量。在一些实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL；如小于或等于0.05ng/mL；如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，该方法包括通过高效液相色谱(HPLC)从样本纯化血管紧张素1。在一些实施方式中，该方法进一步包括用固相萃取柱纯化样本中的血管紧张素1。在其它实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素1离子(一种或更多种)的量关联于样本中血管紧张素1的量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素1生成后的降解程度。

另一方面，提供测量样本中血管紧张素1的量的方法。该方法可包括：(a)电离来自样本的血管紧张素1，产生一种或更多种离子；以及(b)通过质谱法测量至少一种所述离子的量，其中所述离子选自具有下列质/荷比的离子：433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5；以及其中所测的血管紧张素1离子(一种或更多种)的量提供样本中血管紧张素1的量的度量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素1生成后的降解程度。