[发明专利]用于测定来自生物体的生理活性物质的方法和测定装置

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测含有生理活性物质的样品中来自生物体的生理活性物质、或用于测定所述生理活性物质的浓度的测定方法和测定装置，所述生理活性物质具有因与比如内毒素或β-D-葡聚糖的LAL反应而凝胶化的性质。

背景技术

内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁中的脂多糖，是最典型的热原。如果经内毒素污染的输液、注射用药或血液被导入人体，则该内毒素可能诱发比如发烧和休克的严重副作用。因此，要求保存上述药物等以使不被内毒素污染。

同时，鲎变形细胞溶解物（以下，也称为“LAL”）含有由内毒素活化的丝氨酸蛋白酶。在LAL与内毒素反应时，LAL中存在的凝固蛋白原通过取决于内毒素的量而活化的丝氨酸蛋白酶的酶级联而被水解成凝固素，该凝固素彼此缔合形成不溶性凝胶。通过利用LAL的特征，可以以高灵敏度来检测内毒素。

同时，β-D-葡聚糖是构成真菌的细胞膜特征的多糖。例如，β-D-葡聚糖的测定对于多种真菌引起的传染性疾病的筛选是有效的，所述真菌不仅包括一般临床实践中常见的真菌，比如，念珠菌、曲霉和隐球菌，还包括罕见真菌。

在β-D-葡聚糖的测定中，通过利用鲎变形细胞溶解物被β-D-葡聚糖凝固（凝固形成凝胶）的特征，可以以高灵敏度检测β-D-葡聚糖。

已经提出了各种方法作为用于来自生物体的生理活性物质（以下，也称为预定生理活性物质）的检测或浓度测定的方法，所述生理活性物质可以通过鲎变形细胞溶解物来检测，例如，内毒素或β-D-葡聚糖。方法之一是半定量的凝胶化方法，包括：使要用于预定生理活性物质的检测或浓度测定（以下，也简称为预定生理活性物质的测定）的样品与LAL混合所获得的混合物保持静止；经过预定时间后翻转所述容器；根据所述样品下落的有无来判断样品是否已经凝胶化，以检查所述样品是否含有一定浓度以上的内毒素。作为所述方法的其它实例，还给出有比浊法，该方法包括通过测定由LAL和预定生理活性物质之间的反应所致的凝胶形成所造成的样品浊度的时程来分析样品，利用合成底物的比色法，所述底物因酶级联而水解发色，等。

在通过上述比浊法测定预定生理活性物质时，测定样品和LAL的混合物在干热灭菌的玻璃测定池中产生。然后，从外部光学地测定混合物的凝胶化。然而，比浊法可能需要极长时间用于LAL的凝胶化，特别是在含有低浓度的预定生理活性物质的样品中。为了解决该问题，需要可以在短时间内测定预定生理活性物质的方法。作为该方法的实例，提出了可以通过使用例如磁性搅拌子搅拌测定样品与LAL的混合物来形成凝胶微粒，并根据被凝胶微粒散射的激光的强度，或根据透射过该混合物的光的强度，而在短时间内测定样品中预定生理活性物质的存在的激光散射粒子计数方法或搅拌比浊法。

已发展了上述各种方法来减少预定生理活性物质的检测时间或测定时间，或改善测定灵敏度。然而，所有的方法都具有优点和缺点，希望在降低测定时间、提高灵敏度和消除干扰物质方面进一步改善所述方法。

引证列表 

专利文献 

[专利文献 1] JP 2004-061314 A

[专利文献 2] JP 10-293129 A

[专利文献 3] WO 2008/038329 A1。

发明内容

技术问题 

鉴于上述问题而完成了本发明，本发明的目的在于提供测定方法，其可以检测来自生物体的生理活性物质，或可以降低浓度测定中的测定时间，以及提供利用所述方法的测定装置。

问题的解决 

本发明中，本发明的发明人发现，测定时间可以通过直接检测作为蛋白酶级联终产物的凝固素本身（凝固素单体），以及由凝固素缔合而得的极小的缔合产物（凝固素聚集物）。所述方法的最大特征是根据散射光的增加率来检测预定生理活性物质浓度或测定浓度，所述散射光通过用光照射用于测定预定生理活性物质的样品与LAL的混合物而引起混合物的粒子碰撞来产生，并在光接收元件中检测。

即，本发明基于发明人的深入研究所得的新的发现，即，在通过用光照射预定生理活性物质与LAL的混合物而引起混合物中的粒子碰撞来产生散射光时，光接收元件所检测的散射光的增加率取决于所述预定生理活性物质的浓度。

本发明基于比浊法，利用如比色法中使用的非专门试剂，但是与比色法一样，微分法用于判断，通过检测改变自水溶性蛋白质凝固蛋白原的疏水性凝固素单体和通过聚集某些单体而得的低聚物的散射光，其在LAL与预定生理活性物质的凝胶化反应的极早期时间产生。