[发明专利]用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法

说明书

本发明涉及用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法和组件(assembly)。

预想的一个应用领域具体为可包含细菌或病毒，和更通常地，任何核酸的生物学样本的快速分析。

已知的电化学检测方法已使证明靶核酸序列称为可能。有人使用核酸扩增方法，例如PCR(聚合酶链式反应)类型的方法，和循环伏安方法。根据这些方法中的一种，提供包含核酸的生物学样本，所述核酸显示预定的靶核苷酸序列，并向生物学样本加入能氧化靶序列中至少一个核苷酸碱基的氧化剂。扩增装置包含包括可氧化核苷酸碱基的核苷酸类型，和当然意图在执行扩增方法的过程中被消耗的核苷酸，从而产生复制的核酸序列。同时，或者在每个扩增步骤后，对样本施加电场，使氧化剂与可氧化核苷酸碱基反应，并测量因此通过样本的电流。根据这种方法(文件PCT/FR2007/000373中有更具体的描述)当电流随着扩增的过程而降低时，确定存在预定的靶序列及其初始量。这是因为，在扩增过程中，扩增装置的游离核苷酸的数目由于并入合成的核酸中而降低。然后氧化剂只与越来越有限量的游离核苷酸反应。因此，由于氧化反应的发生，电子传递越来越少，并且电流下降。

因此，这种方法使得在任何生物学样本中快速检测和定量给定核酸的存在成为可能。

出现的并且本发明旨在解决的问题不仅在于提供另一种电化学检测方法，其使得在生物学样本中检测靶核苷酸序列的存在成为可能，而且在于能鉴定其性质并将其定量。

为了解决这个问题，根据第一方面，本发明提出用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法。所述方法是根据如下类型(said method is of the type accoding towhich)：提供可包含的预定的靶核苷酸序列生物学样本，作为可激活扩增装置包含游离核苷酸以引起所述预定的靶核苷酸序列的复制，和形成复制的靶核苷酸序列。根据本方法，还提供能与所述核苷酸反应的可氧化还原的化合物，并使所述可氧化还原的化合物与所述生物学样本接触。然后激活所述可激活的扩增装置，并对所述样本施加电场以激活所述可氧化还原的化合物， 并测量通过所述样本的代表所述可氧化还原的化合物的电化学活性的电流。因此，如果电流下降则确定存在所述预定的靶核苷酸序列。根据本发明，提供能在复制过程中插入形成所述复制的靶序列的核苷酸之间的可氧化还原的化合物，所述复制的靶序列引起所述插入的可氧化还原的化合物的电化学活性的抑制，电流因此下降。

除了游离核苷酸，可激活扩增装置包括引物，其为对于待检测的靶核苷酸序列有特异性或互补的寡核苷酸，和聚合酶。此外，如后文将详细解释的，通过使电极接触所述样本和通过在这些电极之间施加电势差而对所述样本施加电场。

因此，本发明的一个特点是提供不会氧化样本中游离核苷酸的核苷酸碱基的可氧化还原的化合物，如同上述现有技术文件中的情况，但是其将插入形成复制的靶序列的核苷酸之间。

优选地，根据连续的扩增循环激活所述可激活的扩增装置和，在每个扩增循环，将所述复制的靶序列加倍。然后可氧化还原的化合物插入形成所述复制的靶序列的核苷酸之间，并相对于施加的电场而损失其可氧化还原的活性。因此，在扩增循环的过程中，测量的电信号下降。

然后有利地记录与电流下降相对应的扩增循环数，从而确定所述样本中所述靶核苷酸序列的浓度。这是因为测量的信号的下降与复制的靶核苷酸序列的量成比例。由此比例可以推导出初始存在于所述样本中的预定的靶核苷酸序列的量。因此，根据一定的扩增循环数重复所述可激活扩增装置的激活，并且记录电流下降时所述扩增装置的循环数，以确定样本中所述靶核苷酸序列的浓度。特别地，生物学样本包含的预定的靶核苷酸序列越多，使电流强度下降所需要的扩增循环数越少。相反，样本包含的预定的靶序列越少，扩增循环数越多。即，如同本说明书其它部分将更详细解释的，这种方法还使在生物学样本中定量预定的靶序列的浓度成为可能。

应详细说明的是，术语“可氧化还原的化合物”不仅描述氧化还原化合物，还描述能够在某些条件下被氧化和在其它条件下被还原的化合物。