[发明专利]制备基于烟碱的半抗原的方法

说明书

发明领域

本发明涉及作为戒烟疫苗有用成分的基于烟碱的半抗原的制备方法。

发明背景

烟草是世界上最广泛使用的成瘾药物。烟草的主要成瘾成分是烟碱，一种源于烟草叶的生物碱。以香烟的形式吸入烟草是美国和许多其他国家中可预防死亡的单一首要原因。同时，大多数吸烟者意识到肺癌、冠心病、慢性肺病和中风可能由吸烟引起，大多数吸烟者尝试戒烟但失败。

各种行为和药物治疗可用于帮助吸烟者戒烟，包括烟碱替代疗法(例如，使用烟碱口香糖或透皮贴剂)和抗抑郁治疗(例如，使用安非他酮)。但是结果是喜忧参半。它们可能发生了不利的副作用。并且它们极大地依赖吸烟者保持不吸烟的意志力。

美国专利6,932,971公开了用于戒烟的治疗性疫苗。当施用时，该疫苗诱导高水平的烟碱特异性抗体产生，其与血中的烟碱结合。因为附着在抗体的烟碱复合物太大，因而不透过血脑屏障，据信吸收至脑中的烟碱和相继的大脑中感知烟碱的神经元的刺激被显著地降低或者甚至阻止了。以此方式，烟碱驱动成瘾并诱发满足感的刺激被降至最低。

美国6932971的疫苗包含基于烟碱的半抗原，其通过化学桥接连接于由大肠埃希菌产生的噬菌体Qβ重组病毒样粒子的表面。基于烟碱的半抗原是已知的烟碱衍生物1-(反式-3’-羟甲基-烟酰基)-6-羟基-琥珀酰亚胺基-琥珀酸酯(C₁₉H₂₃N₃O₆)。这一半抗原通过反式-3’-羟甲基烟碱与琥珀酸酐反应合成得到琥珀酰化的羟甲基-烟碱、O-琥珀酰基-3’-羟甲基-烟碱，以Langone等人公开的方法“Radioimunno-assay of nicotine，cotine andγ-(3-pyridyl)-γ-oxo-N-methylbutyramide”，Methods Enzymol.84，第628-640页，Academic Press 1982为基础。然后将该化合物与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，得到O-琥珀酰基-3’-羟甲基-烟碱的N-羟基琥珀酰亚胺酯，即上文提及的1-(反式-3’-羟甲基-烟酰基)-6-羟基琥珀酰亚氨基-琥珀酸酯。

在US 6,932,971中公开的方法对于工业化生产是不可取的，因为由这种方法制备的半抗原可能包含残留量的EDC，其是有毒的和致突变的。半抗原还是本质上不稳定的分子。这使得半抗原的处理与制备困难。因此需要避免或至少尽量使这些问题减至最少的用于制备半抗原的方法。

发明概述

第一方面，本发明涉及用于制备式I或其盐或溶剂合物的基于烟碱的半抗原的方法

其中n是0至5的整数，并且R¹和R²一起构成包含1至4个环氮原子并任选1至4个选自氧和硫的其他杂原子的N-键合的5至10元杂环基团。所述的杂环基任选在1、2、3或4位上被卤素、氰基、羟基、氧代、氨基、氨基羰基、硝基、C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基或C₃-C₆-环烷基取代；所述方法包括以下步骤：

(a)式II化合物或其盐或溶剂合物与式III化合物或其盐和聚合物支撑的偶联剂反应；

其中n是从0至5的整数；

其中R¹和R²如上文所定义；和

(b)过滤步骤(a)的产物，以得到如上文所定义的游离形式、盐形式或溶剂合物形式的式I化合物。

第二方面，本发明涉及基于烟碱的式I的半抗原，其通过以上提及的用于制备基于烟碱的式I的半抗原的方法获得或得到。优选地，半抗原是以组合物形式提供的，其中例如通过¹H NMR测定的半抗原纯度大于80、85或90％。

第三方面，本发明提供了用于制备半抗原载体结合物的方法，该方法包含将基于烟碱的式I的半抗原(通过本发明第一方面的方法得到或获得)，与一种或多种病毒样粒子的包衣蛋白(VLP)共价结合。在一个实施方案中，VLP包含RNA噬菌体、优选噬菌体Qβ的包衣蛋白。

发明详述

本说明书中使用的术语具有以下含义：

本文使用的“任选被取代”意指所指基团可在一个或多个位置被下文列出基团的任何一种或任意组合取代。

本文使用的“卤素”(halo)或“卤素”(halogen)可以是氟、氯、溴或碘。卤素适宜地为氯。