[发明专利]抗体纯化工艺

说明书

本申请要求以提交于2008年6月3日美国临时专利申请号61/058545为基础享受优先权，其被全文引用在此作为参考。

技术领域

本披露涉及蛋白质纯化的方法和混合物，具体地，涉及抗体纯化工艺的方法和混合物，该工艺包括去除聚集物和使用强化溶解性的添加剂(例如带有两性离子的化合物)以强化抗体溶解性、避免聚集物的生成或在离子交换层析中发生闭塞，从而产生高纯度的基本不含聚集物的蛋白质产品。

背景技术

在血液和淋巴液中发现的IgM抗体通常是首先响应感染的一类抗体，并能够引起其他免疫系统细胞破坏外来物质。虽然IgM在医疗应用上具有很好的前景，但是IgM具有一些能够限制其在标准抗体净化工具中使用的特性。相比IgG，IgM的溶解性较差，且在极端pH值下和低导电率环境下更容易变性(沉淀，包括聚集物的生成)。IgM通常能够耐受高盐度，该特性能够用于离子交换层析技术，但是当其暴露于高疏水表面时容易发生变性，这限制了疏水作用层析法(HIC)的有效性。更进一步地，尽管IgM在HIC中在合理的低盐度下能够以轮廓分明的出峰从中度疏水底物中洗脱，对中度疏水介质优选较高盐度以支持高容量，然而IgM会在较高盐度下发生沉淀。由于IgM通常电荷量比IgG更大，IgM与离子交换体的连结强度比IgG更大，且比大多数污染物的连结强度大得多。IgM的大尺寸对纯化是一种挑战，由于扩散系数小，对质量输运依赖于扩散作用的颗粒结构的多孔离子交换介质而言所述大尺寸会成为一个问题。

尽管IgM的一些性质会限制其在标准纯化工具中的应用，IgM单克隆的电荷性质也提供了对IgG很少或从未遇到过的纯化机会。这些电荷性质允许开发出纯化正交工艺，该工艺仅需几个步骤，无需对产品施加不必要的应力。事实上，临床级的IgM纯化通常可通过三个在羟磷灰石、阴离子交换和阳离子交换上的连结-洗脱层析步骤实现。IgM纯化中的大部分进步来自使用单片结构的离子交换体，所述单片结构的离子交换体具有高连结容量并能承受快速流速。更进一步地，单片的膜状离子交换体在质量传输上依赖于对流而非扩散，由于对流与尺寸和流速无关，容量和溶解不受到IgM的大尺寸的影响。省略亲和步骤对开发有效、经济的纯化工艺也是一个积极的贡献。通过采用在线稀释加载样本，避免中间透析，也可提高工艺经济性。在每一个步骤中，回收率与IgG纯化中达到的回收率相当。(Gagnon等人，Purification of IgM Monoclonal antibodies，BioPharm International Supplements，March 2008，pages 26-35(March2，2008)；Gagnon等人，IgM Purification：The Next Generation，13thAnnual Waterside Conference，Miami，February 4-6，2008，available atwww.validated.com as Document No.PSG-080129)

去除聚集物

许多蛋白质，包括例如IgG和IgM的抗体，能够形成聚集物，所述聚集物必须在纯化过程中去除，为了提供具有所需纯度和产品安全性(对医疗用蛋白质而言)的蛋白质产品。尽管去除聚集物是产品安全性的关键决定因素，其可能增加产品加工难度、增加纯化成本，并限制了对最终纯化(“精细纯化”)方式的选择。例如，尺寸排阻层析(SEC)去除聚集物并允许缓冲液更换，但是SEC也存在过程慢、容量低、需要不成比例地大的柱床(需要极高的填充技术)且需要大量的缓冲剂。吸附方法在去除聚集物的有效性上存在限制，它们的选择性并不直接与蛋白质的尺寸相关，相比非聚集态的蛋白质，聚集物被保留的趋势要强得多(可能是由于其参与了大量的与吸附固体物质之间的相互作用)，而超乎预料的分离度是由于克隆之间以及产品的聚合与非聚合状态之间的电荷分布的差异。