[发明专利]获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基因植物的方法

说明书

本发明涉及获得基于RNA干扰(RNAi)对植物病原体攻击有抗性的转基因植物以保护所述植物免受寄生虫和植食性动物(phytophage)的攻击的方法，所述方法包括在植物组织中表达适合于抑制GPCR受体的功能性的dsRNA，所述GPCR受体的功能对于真菌、食草昆虫或植物病原线虫是至关重要的。具体地，本发明涉及可使用免受真菌、食草昆虫或植物病原线虫攻击的预防性保护处理获得的，在其组织中表达dsRNA的植物。

RNAi是在进化过程中保存的存在于所有生物中的自然过程。其是各种双链RNA片段籍以能够干扰和消除基因表达的基因沉默机制。一旦确定了双链RNA分子(dsRNA)，所谓的RNAi机器就能够激活RNAi机制(Brandt，2002)。

通过称为dicer的酶，dsRNA序列被切成具有更短长度(19-21个碱基对)的片段(Hamilton和Baulcombe，1999)。短dsRNA片段(称为短干扰RNA或siRNA)与称为RISC(RNA-干扰沉默复合物)的酶促复合物结合。dsRNA可能通过解旋酶(helicase)打开：只有反义RNA链仍然与RISC结合，而有义链被降解。RISC复合物能够在存在于细胞溶胶中的众多mRNA中识别与所述同一复合物相结合的反义RNA片段互补的mRNA。如果siRNA与mRNA之间的配对是完全的(或几乎完全的)，那么RISC的组分(称为argonaute蛋白)能够切割mRNA(Hammond等人，2001)。两个所得的mRNA片段(一个在5’不具有头，而另一个在3’不具有A极的尾)从而能够被细胞本身的RNA酶快速降解。另一种常见蛋白质(虽然未普遍存在于RNAi机器中)是RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)，其从单个螺旋RNA模块(mould)开始合成dsRNA以产生RNAi扩增机制。

有关RNAi可作为强大且容易的基因沉默方法这一发现已唤起了整个科学界的关注。该现象的普遍存在已使得其能够在许多物种中得到研究。许多实验实际上基于将整个生物体简单地浸入含有dsRNA的溶液或通过用表达dsRNA的细菌进行的喂饲。这已使得能够快速鉴定在秀丽隐杆线虫中参与RNAi的基因，以及在果蝇、植物和真菌中发现其同源物，并且已证明最初分类为抑制性PTGS(quelling PTGS)(转录后基因沉默)的现象全都是其根源建立在单个祖先机制中的单一过程的部分。

在植物背景中，利用RNAi的基因沉默的应用已使得能够产生具有增加的对疾病、昆虫的抗性水平或具有高营养品质的具有农业利益的品种。

例如，一些研究者通过RNAi技术已促成改良水稻植物。他们降低了麦谷蛋白的水平，产生称为LGC-1(低麦谷蛋白含量1)的水稻品种，其适合于不能降解麦谷蛋白的肾虚患者(Kusaba等人，2003)。

其他RNAi应用涉及通过沉默参与毒素的生物合成的基因而除去植物内毒素。利用dsRNA使咖啡植物的可可碱合酶失活，从而使得能够生成去除了咖啡因的咖啡(Ogita等人，2003)。

还已对具有农业利益的植物的病原体和植食性动物进行了使用dsRNA的沉默实验，以抑制其一些至关重要的基因的表达。在鞘翅类昆虫(coleopteran)(赤拟谷盗(Tribolium castaneum))末期幼虫和成虫中显微注射dsRNA已使得基因得到沉默并且其功能得到研究(Tomoyasu和Denell，2004)。一些研究者已使用用富含特定dsRNA的合成饮食喂养的玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgiferaLeconte)的幼虫进行测试，以鉴定该昆虫的生活力所必需的基因。此类测试鉴定到其失活(因干扰而引起的失活)引起幼虫死亡的14个至关重要的基因。表达一种此类dsRNA的转基因玉米植物已显示可与利用表达毒素Bt的转基因植物获得的保护水平相当的高保护水平(Baum等人，2007)。然而与后者不同，表达dsRNA的转基因植物具有减少的环境影响。事实上，在该情况下昆虫基因的抑制作用只取决于siRNA与待灭活的靶序列之间的特异性识别。因此，与将“外源”分子导入至环境中和与非靶生物的相互作用相关的问题得到消除。

为了控制病原体和植食性生物，待灭活的基因靶的选择是至关重要的。