[发明专利]白蚁纤维素酶在酵母中的异源表达

说明书

背景技术

木质纤维素生物质被广泛认为是用于生产可再生燃料和化学物质的原材料的有前景的来源。阻碍从生物质原料更加广泛地产生能量的主要障碍是普遍缺乏用于克服从这些材料转化成有用燃料的阻力的低成本技术。木质纤维素生物质含有可被转化为乙醇的碳水化合物组分(例如纤维素和半纤维素)。为了转化这些组分，必须把纤维素和半纤维素最终转化或水解为单糖；长期被证明有问题的正是该水解过程。

生物介导的过程是用于能量转化的有前景的选择，尤其是将木质纤维素生物质转化为燃料。涉及酶促或微生物水解的生物质处理方案通常涉及4个生物介导的转化：(1)产生使糖分解的酶(纤维素酶和半纤维素酶)；(2)存在于经预处理的生物质中的碳水化合物成分水解为糖；(3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和(4)戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)的发酵。这4个转化发生在称为联合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)的工艺配置中的单一步骤中，联合生物加工与其它整合度较低的配置的区别在于，前者不涉及用于产生纤维素酶和/或半纤维素酶的专门处理步骤。

CBP提供了比特征在于专门的纤维素酶生产的方法成本更低且效率更高的潜力。有益之处部分来源于避免了与例如生产纤维素酶所需的底料、原材料和工具相关的资金成本。此外，使用CBP，数个因素支持实现较高速率的水解，因此减小了反应器的体积和资金投入，包括酶-微生物协同作用，以及使用噬热生物体和/或复合的纤维素酶系统。此外，纤维素粘附性的分解纤维素的微生物可能相对于非粘附性的微生物(例如污染物)成功地竞争纤维素水解的产物，这会增加基于微生物纤维素利用的工业方法的稳定性。通过以下两个策略在开发能够进行CBP的微生物方面取得了进展：对天然存在的分解纤维素的微生物进行工程化改造以改善与产物相关的特征，例如产率和效价；以及对表现出高产物产率和效价的不分解纤维素的生物体进行工程化改造以表达异源纤维素酶和半纤维素酶系统以实现纤维素和半纤维素的利用。

天然纤维素降解需要三种主要类型的酶活性：第1种类型是内切葡聚糖酶(1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.4)。内切葡聚糖酶在无定形纤维素的纤维素多糖链中随机切割，产生不同长度的寡糖，从而产生新的链末端。第2种类型是外切葡聚糖酶，包括纤维糊精酶(1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.74)和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶；EC 3.2.1.91)。外切葡聚糖酶以前进的方式作用于纤维素多糖链的还原末端或非还原末端，释放葡萄糖(葡聚糖水解酶)或纤维二糖(纤维二糖水解酶)作为主要产物。外切葡聚糖酶还可以作用于微晶纤维素，推测为使纤维素链从微晶结构上脱落下来。第3种类型是β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21)。β-葡萄糖苷酶将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解为葡萄糖单元。

可以获得多种植物生物质资源作为生产生物燃料尤其是生物乙醇的木质纤维素。主要的资源有：(i)来自造纸厂、锯木厂和家具生产厂的木材残余物；(ii)城市固体垃圾；(iii)农业残余物和(iv)能源作物。这些生物质资源中的特别是纤维素组分的预转化(使用物理、化学或酶促方法)为可发酵的糖(葡萄糖、纤维二糖和纤维糊精)将能够使其发酵为生物乙醇，条件是使用必要的有发酵力的具有利用这些糖的能力的微生物。

在世界范围内而言，每年产生1.3×10¹⁰公吨(干重)的陆生植物(Demain，A.L等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev.69，124-154(2005))。植物生物质由大约40-55％的纤维素、25-50％的半纤维素和10-40％的木质素组成，这取决于来源是硬木、软木还是草(Sun，Y.and Cheng，J.，Bioresource Technol.83，1-11(2002))。存在的主要多糖是不溶于水的纤维素，其包含可发酵糖(葡萄糖、纤维二糖或纤维糊精)的主要组分