[发明专利]形成鉴别标记物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种形成生物体内分子标记物，特别是鉴别标记物的方法。该方法还涉及将一种选择性标记物引入生物体的种质中，以及该标记物在例如植物育种过程中的用途。

背景技术

数十年来，DNA标记物技术正显著地提高着植物育种的效率，其是通过基于容易的试验标记物的选择而非通常困难的表型性状的选择而实现的。然而，这样的鉴别标记物的形成以及使用这些标记物的效率往往是费力并且费时的过程。首先，鉴别标记物的形成遵循由以下程序起始的过程

1)绘制目标性状之下的基因的遗传位置图谱，

2)识别侧翼标记物，

3)通过紧密连接的标记物的识别精细绘制基因图谱，

4)确定最相关标记物的DNA标记物序列，

5)确定用于绘制目标基因图谱的亲代系之间标记物基因座上的序列变异，

6)形成简单的PCR分析，

7)测定植物材料的遗传背景(种质)中的预测值，其中测定鉴别标记物。

这里所用的种质是用于描述遗传资源或者更确切地讲生物体的DNA，以及这些材料的收集物的术语。育种者使用术语种质以表明它们的遗传物质收集物，从种质中它们能够产生变种。

幸运的是，近来的进展已经显著加快了步骤1-4(Morgante和Salamini 2003 Curr.Opinion in Biotechnol 14：214-219；Varshney等，2005 TiPS 10：621-630)，特别是当处理单基因性状时。步骤5-6依赖于序列变种(SNP)周围独特DNA标记序列片段(stretch)的存在，所述序列变种用于开发鉴别分析。植物基因组被重复序列完全地分散，所述重复序列严重妨碍了形成鉴别标记物分析的可能性。尤其是对于具有较大基因组尺寸的农作物，低拷贝DNA片段的识别就好比是大海捞针了。最后，步骤7非常依赖于1)农作物的繁育方式，和2)农作物基因组中的遗传变异性水平。当发生功能性变异时，该变异会位于其他预成DNA多态性的单倍体上。由于性状会通过随机杂交的后代传递，因此会发生很多重组事件，所述重组事件将使得原始单倍体成为小连锁障碍。这将引起性状基因从大部分其原始单倍体的特定等位基因上分离。这样的结果是只有具有与性状基因极端紧密连结的DNA多态性或甚至性状基因多态性自身可用于转化成有用的DNA标记物。作为远系杂交种随机杂交种群的一个例子，重组和重组事件的高交换率产生了含有性状的区域，该区域是(理论上讲)非常小的。因此，与基因完美相关的DNA标记物是很难找到的。作为相反的一个例子，自交种种群中的连锁障碍趋于相对较大，因为自交增加了纯和性，从而限制了杂合体的数量，而杂合可以被重组所搅乱。然而，对于栽培种的遗传基础非常窄的农作物来讲，鉴别任何作为DNA标记物形成的起始点的DNA多态性都是困难的，尽管存在有相对较大的连锁障碍。

发明内容

本发明人旨在开发一种产生选择性标记物的方法，所述方法避免了上述问题。

在本申请中，所述方法在目标区域引入了独特的、人造的和选择性的标记物，而不是鉴别和开发自然产生的序列变种。本方法的原理是，基于潜在标记物基因座上的序列知识，可以设计独特的标记物，并且将它们引入含有目标性状的种系中。优选的这些标记物的适用性是，连续几代之后新引入的标记物与目标性状始终如一地共分离。本发明人已经发现了一种以这种方式在目标区域中引入标记物的方法，该标记物作为具有广泛预测价值的标记物是有用的。

本发明人发现一种基于鉴别和/或选择DNA片段并且将该片段转换成为选择性分子标记物，进而克服以上困难的策略，所述DNA片段与目标性状密切相关(即具有预定义的与目标特征共分离的一致性)，所述转换使用定向突变、定向核苷酸交换(TNE)方法完成。特别地，本发明人发现了一种用于确定需要作出何种改变并且设计所需标记物的方法，以使任何遗传变异性减少到最小，并且标记物的品质，即其相关性状的预测值在种质内是最佳的，但是相比标记物最初由其形成的种质，其在不同的种质中也是有用的。

因此，本发明涉及一种用于在种质中引入一种或多种(独特的并且选择性的)分子标记物的方法，所述标记物与目标性状紧密关联，并且所述标记物位于基因组中的一个位置，该位置虽然与所希望的性状紧密相关，但是不含有足够的标记物信息。在该DNA片段中，使用TNE产生人造的并且独特的多态性，其随后可以用作选择性的分子标记物。本发明还涉及TNE用于在生物体中产生独特并且选择性标记物的用途。

因此，在第一个方面，本发明涉及在生物体中形成鉴别标记物的方法，包括步骤：

-选择目标性状；