[发明专利]具有提高的活性的β-葡糖苷酶变体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及分解木质纤维素生物质的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及包含至少一个氨基酸修饰的β-葡糖苷酶变体，这些修饰的氨基酸根据里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ ID No.2的编号位于第225、238、240和241位。本发明还涉及这些具有改善的效能的变体在纤维素分解方法和生物燃料(例如：乙醇、丁醇、异丙醇)的制备方法中的用途。

背景技术

乙醇是一种清洁燃料，并且起始原料来源广泛，因此从纤维素制备乙醇的可能性已经得到了极大的关注。

该方法的天然纤维素起始原料用术语“生物质”表示。许多类型的生物质，包括木材、农业废弃物、草本作物和固体废物，被认为可以用作制备生物燃料的起始原料。这些原料主要由纤维素、半纤维素和木质纤维素组成。

纤维素是由葡萄糖分子组成的聚合物，其中葡萄糖分子通过β1-4键连接，该连接对于酸、酶或微生物的分解或解聚作用具有很强的抗性。一旦纤维素转变成葡萄糖，所述葡萄糖就易于通过酵母发酵形成生物燃料，例如乙醇。

这些将纤维素转变成糖的传统研究方法都是基于酸水解作用。这些方法可在浓酸或稀酸存在的情况下进行。但是，这些方法存在一些缺点，例如在使用浓酸时，酸的回收率差，在使用稀酸时，葡萄糖产率低，这些都使酸水解方法不能实现商业化。

为了克服酸水解方法的缺点，最近提出了使用纤维素型酶进行酶水解的纤维素转化方法。但是酶水解木质纤维素生物质(例如纤维素)的方法也有工业生产成本过高的缺点。因此，有必要使用分泌更加有效的纤维素酶的微生物株。

在此方面，许多微生物含有水解纤维素的酶，例如真菌：木霉菌(Trichoderma)、曲霉菌(Aspergillus)、腐质霉菌(Humicola)或镰孢菌(Fusarium)，以及细菌，例如：热单孢菌(Thermomonospora)、芽孢杆菌(Bacillus)、纤维单胞菌(Cellulomonas)和链霉菌(Streptomyce)。这些微生物中的酶在用于将纤维素转变成葡萄糖时具有三种活性类型，因此可被分成三组：内切葡聚糖酶，随机地作用于纤维素纤维的内部；外切葡聚糖酶，作用于纤维素的末端，释放出纤维二糖；β-葡糖苷酶，将此纤维二糖水解成葡萄糖。这些β-葡糖苷酶是纤维素转化方法的限速步骤。这是因为该方法的主要困难在于纤维二糖转化成葡萄糖，因为在制备生物燃料时，在方法结束时任何未水解的纤维二糖代表收率的损失。

由于一些产生纤维素酶的微生物，包括木霉菌，产生的β-葡糖苷酶极少，因此在酶水解方法中纤维二糖的蓄积是一个主要的问题。具体而言，工业木霉菌株产生的所有蛋白质中，β-葡糖苷酶类型要少于1％。因此，较低的β-葡糖苷酶量导致将纤维二糖水解成葡萄糖的容量较低，从而导致了所述纤维二糖在系统中的蓄积。而且，高浓度的纤维二糖抑制了其它以纤维二糖作为最终反应产物的纤维素酶，特别是外切葡聚糖酶的活性。

已经提出了几种提高微生物中的β-葡糖苷酶活性，从而提高纤维二糖到葡萄糖的转化率的方法。

第一种方法包括加入外源性产生的β-葡糖苷酶到微生物分泌的混合物中，以促进水解。然而，该方法由于成本昂贵而没有商业可行性。

第二种方法，如WO 92/010581中描述，采用基因工程方法将新的β-葡糖苷酶基因的拷贝插入到微生物的基因组中，如此所述微生物产生大量的酶。

第三种方法，如WO 99/46362中描述，包括使用包含启动子、成熟的β-葡糖苷酶基因和木聚糖酶分泌信号序列的基因构建物对微生物进行遗传修饰。木聚糖酶分泌信号序列的存在使得可能显著提高微生物产生的β-葡糖苷酶的量。

然而，为了使木质纤维素生物质的水解有效和有经济价值，该酶混合物必须由一种并且是唯一的菌株产生，并且必须包括平衡比例的各种酶活性(尤其是，但不仅仅是，外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶)。举例来说，在里氏木霉菌的天然混合物中，一般存在70-80％的外切葡聚糖酶、15-20％的内切葡聚糖酶、数个百分比的半纤维素酶和约0.5％的β-葡糖苷酶。该混合物完全适合水解大多数的预处理的底物(例如，在酸性条件下蒸汽爆破(steam-explode)处理的麦秆)，并且收率可以接受。总之，如果通过富集酶的量以增加β-葡糖苷酶的活性，其必须不能损害其它酶的活性。

因此，不显著改变混合物中所有酶的比例而获得高β-葡糖苷酶活性的可能性，对于将木质纤维素生物质转变成生物燃料的方法具有重要意义。

发明内容