[发明专利]木质素所致失活降低的第6家族纤维素酶

权利要求书

1.经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纤维素酶，其包含一个或多个选自下列的氨基酸替换：

用中性或酸性氨基酸替换129和410位中一个或多个位置的碱性氨基酸；

用酸性氨基酸替换322和363位中一个或多个位置的中性氨基酸；和

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

其中，所述经修饰TrCel6A的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约47％至约99.9％的同一性。

2.权利要求1的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述经修饰TrCel6A纤维素酶的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约70％至约99.9％的同一性，并且其中与亲本TrCel6A纤维素酶相比，所述经修饰TrCel6A纤维素酶显示出木质素所致失活程度减少至少15％。

3.权利要求2的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述经修饰TrCel6A纤维素酶的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约90％至约99.9％的同一性。

4.权利要求1至3任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述氨基酸替换选自：K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。

5.权利要求1至4任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶，其还包含选自下列的一个或多个氨基酸替换：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P。

6.分离的基因构建物，其包含编码权利要求1至5任何一项所述经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列。

7.分离的遗传修饰微生物，其含有权利要求6的基因构建物。

8.权利要求7的分离的遗传修饰微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的物种。

9.权利要求8的分离的遗传修饰微生物，其中所述微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。

10.生产经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，其包括下列步骤：在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达和分泌的条件下，在培养基中培养权利要求7的遗传修饰微生物，以及从所述培养基中回收经修饰TrCel6A纤维素酶。

11.水解纤维素底物的方法，其包括在木质素存在下将底物与权利要求1至5任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶相接触。

12.权利要求11的方法，其中所述纤维素底物是经预处理的木质纤维素原料，其中酶促水解产生可发酵的糖。

13.权利要求12的方法，其中所述经预处理的木质纤维素原料选自：玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和废渣、甘蔗渣、硬木、软木、木屑、柳枝稷、芒草、网茅草和草芦。

14.生产经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，其包括以下步骤：(i)用权利要求6定义的基因构建物转化真菌宿主细胞以产生重组真菌菌株；(ii)选择表达经修饰TrCel6A纤维素酶的重组真菌菌株；以及(iii)在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达的条件下在深层液体发酵中来培养步骤(ii)中选择的重组真菌菌株。

15.经修饰的第6家族糖苷酶，其选自下列：

TrCel6A-K129E-S413P(SEQ ID NO：37)；

TrCel6A-S186T-S413P(SEQ ID NO：38)；

TrCel6A-A322D-S413P(SEQ ID NO：39)；

TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ ID NO：40)；

TrCel6A-R410G-S413P(SEQ ID NO：41)；

TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO：42)；

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ ID NO：43)；和

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ ID NO：44)。