[发明专利]木质素所致失活降低的第6家族纤维素酶

说明书

技术领域

本发明涉及经修饰的第6家族纤维素酶(Family 6 cellulase)。更具体地说，本发明涉及木质素所致失活降低的经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纤维素酶。本发明还涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核苷酸序列，还涉及从宿主菌株中生产经修饰纤维素酶的方法和经修饰TrCel6A纤维素酶在木质纤维素底物水解中的用途。

背景技术

地球上超过一半的有机碳被发现存在于植物的细胞壁中。植物细胞壁包括三种主要的化合物：纤维素、半纤维素和木质素。这些化合物被统称为“木质纤维素”，它们代表了用于发酵制备乙醇或其它高值产品的糖和其它有机分子的潜在来源。

由于纤维素乙醇的环境友好性和可持续性，木质纤维素生物质向乙醇的转化已成为新能源政策的关键特征。目前正在开发若干技术用于纤维素的转化。值得关注的有以下方法，通过将木质纤维素生物质预处理，而提高其对水解酶的敏感性，而后酶促水解成糖，这些糖再被发酵成乙醇或其它高值有机分子(例如丁醇)。常见的预处理方法包括稀酸蒸汽爆破(Dilute acid steam explosion，美国专利编号4,461,648)、氨冷冻爆破(Ammonia freeze explosion，AFEX；Holtzapple et al.，1991)和有机溶剂萃取(Organosolv extraction，美国专利编号4,409,032)。水解和发酵系统可以是独立的(依次水解和发酵(Sequential hydrolysis and fermentation，SHF))，也可以是同时发生的(同时糖化和发酵(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF))。在所有情况下，半纤维素和纤维素被分解成可发酵糖，同时木质素被分离出来并且可以用作固体燃料或作为其它有机分子的来源。

对于将经预处理的木质纤维素生物质转化成糖的酶的选择在很大程度上取决于预处理的方法。稀酸蒸汽爆破引起了半纤维素的显著化学水解，因此使得用于将半纤维素转化为糖类的酶与此过程关系不大。相比之下，AFEX和有机溶剂萃取都保留了半纤维素和纤维素的大致完整性。与稀酸蒸汽爆破或AFEX不同，有机溶剂萃取从底物中去除了相当一部分的木质素。在所有情况下，酶促水解的主要目标是纤维素，使用纤维素酶的组合将其转化为糖类。

纤维素酶有两种基本类型：内切葡聚糖酶，其切割纤维素链中间的糖苷键，并且这样做时，产生了新的链末端；纤维二糖水解酶，其从纤维素链的末端切下短的寡糖。葡萄糖苷酶将短的寡糖消化成单糖。因此，这三种酶组分协同作用产生高效的纤维素水解酶系统。大多数纤维素酶具有相似的模块结构，其由催化结构域、连接肽和糖结合模块(Carbohydrate-binding module，CBM)组成。

经修饰的纤维素酶和修饰的方法已有广泛描述。例如，已有报道改善热稳定性的里氏木霉Cel7A和Cel6A的变体(美国专利编号7,375,197；WO 2005/028636，美国专利公开编号2007/0173431；美国专利公开编号2008/167214，WO 2006/074005；美国专利公开编号2006/0205042；美国专利编号7,348,168；WO 2008/025164)。特别是，在里氏木霉Cel6A的第413位使用脯氨酸替代丝氨酸，或在其它的第6家族纤维素酶中使用脯氨酸替代等同于第413位上的氨基酸以赋予增强的热稳定性(WO2008/025164)。已有显示，在里氏木霉Cel6A和其它第6家族纤维素酶的催化结构域中在等同于103、136、186、365和410位的位置上的突变引起葡萄糖所致抑制作用的降低(美国专利公开编号2009/0186381)。已创造出对用于去污剂制剂的蛋白酶和表面活性剂具有抗性的变体，以用于纺织应用(WO99/01544，WO 94/07998和美国专利号码6,114,296)。