[发明专利]降低诊断杂交测定中对靶核酸的序列变异的依赖性的方法

权利要求书

1.设计为用于扩增靶核酸序列的引物，所述靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，其中所述引物包含与所述靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于所述引物中。

2.权利要求1的引物，其中所述引物与含有至少两个变异的靶序列互补，每个变异由至少一个保守核苷酸相互分开。

3.扩增靶核酸序列的引物对，所述靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，其中所述引物中的至少一种是根据权利要求1或2设计的。

4.设计为用于检测靶核酸序列的探针，所述靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，其中所述探针包含与所述靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于所述探针中。

5.权利要求4的探针，其中所述探针包含至少一种标记物。

6.权利要求1-4任一项的引物或引物对或探针，其中所述靶序列是靶RNA。

7.权利要求1-3任一项的引物或引物对，其中一种引物具有启动子序列。

8.一种扩增样品中的核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，所述方法包括对样品进行扩增反应放大所述靶序列的存在，所述扩增反应使用

1)第一引物，其能够特异地杂交至靶序列的一个区域并能够在延伸条件下引导第一引物向第二引物杂交区域延伸，以及

2)第二引物，其能够特异地杂交至靶序列另一个区域的互补序列并能够在延伸条件下引导第二引物向所述第一引物杂交区域的互补序列延伸，以及

其中所述至少一个变异位于所述引物中的至少一种引物的杂交区域中，以及

其中所述引物中的至少一种引物包含与所述靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于所述引物中。

9.一种检测样品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，所述方法包括

(a)对所述样品进行扩增反应检测靶序列的存在，所述扩增反应使用

(1)第一引物，其能够特异地杂交至靶序列的一个区域或靶序列的一个互补区域，并能够在延伸条件下引导第一引物向第二引物杂交区域延伸，以及

(2)第二引物，其能够特异地杂交至靶序列另一个区域或靶序列的另一个互补区域，并能够在延伸条件下引导第二引物向所述第一引物杂交区域的互补序列延伸，以及

(b)使用至少一种探针对样品进行检测反应检测所述靶序列的存在，所述探针能够特异地杂交至靶序列中位于第一引物能够杂交的区域和第二引物能够杂交的区域之间的区域，

其中所述至少一个变异位于所述引物中的至少一种引物的杂交区域中，并且

其中所述引物中的至少一种引物包含与靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于所述引物中。

10.权利要求8或9的方法，其中所述扩增反应选自基于转录的扩增和PCR。

11.权利要求10的方法，其中所述基于转录的扩增是NASBA。

12.权利要求8或9的方法，其中所述靶序列是靶RNA。

13.一种检测样品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，所述方法包括

(a)至少一种能够特异地杂交至靶序列的一个区域的探针，以及

(b)检测所述靶序列的存在，

其中所述至少一个变异位于所述探针中的至少一种探针的杂交区域中，以及

其中所述探针中的至少一种探针包含与靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于所述探针中。

14.权利要求13的检测方法，其中在检测由所述靶序列产生的扩增子的存在的检测反应之前进行扩增反应。