[发明专利]降低诊断杂交测定中对靶核酸的序列变异的依赖性的方法

说明书

发明领域

本发明涉及设计用于克服扩增效率差异的引物，出现所述扩增效率差异的具体原因在于引物结合的易变性，靶核酸序列的非保守核苷酸，例如不同基因型之间的变异。通过缺失非保守核苷酸的互补碱基，引物(称作缺失引物)对所有靶(基因型)的结合将会相同。本发明可以转用于其它技术层面，例如在定量测定中作为内部对照和/或检测其它与靶竞争的核酸序列，其中在靶核酸的变体之间，通过所述缺失引物对靶、内部对照和/或竞争性序列进行的扩增是可比的。

发明背景

分子生物学的发展使得可以通过使用扩增技术实现核酸的灵敏检测。扩增的方法已经变成非常强大的工具，因为它们可以在相对短的时间内实现非常少量的核酸的指数扩增。这产生了能够灵敏地检测低至单拷贝RNA或DNA的强大的测定方法。

已经开发了多种的扩增技术，例如PCR、LCR、NASBA、TMA和SDA，并为本领域技术人员所熟知。这些方法每个都基于不同的作用机制，但全部都依赖于一种或多种引物退火至靶核酸序列或其互补序列。

在靶或其部分的扩增期间或扩增之后，要检测产生的扩增子的存在或扩增子的量。这可以用多种已知技术进行，例如在凝胶上分离样品随后进行印迹和探针检测。这只可以在扩增完成后进行。在一种均质的方法中，扩增和检测不对反应组分进行分离。在扩增过程中检测扩增子。因此，可以实时监测扩增子的产生并且因此获得的数据可以用于确定扩增子存在与否和/或扩增子的量。

在核酸序列的扩增和检测中，对用作引物和探针的寡核苷酸的选择对于测定的灵敏度和特异性是关键的。待扩增的序列通常仅以微量存在于样品(例如获得自怀疑被病毒感染的患者的血液样品)中。引物应当与靶序列充分互补以使得有效扩增存在于样品中的病毒核酸。如果引物不恰当地退火至靶序列(由于两条链中核苷酸碱基的错配)，扩增被严重阻碍。当靶不是线性的而是具有特别的结构，其较不易被引物接近，从而也导致扩增减少。这将影响测定的灵敏度并且会造成假阴性的测试结果。

引物的有效杂交一般需要至少15个连续的互补核苷酸。如果使用更少的核苷酸，引物特异性和非特异性退火的比例将降低至靶核酸能发生有效扩增的比例以下。如果靶核苷酸序列的几个遗传学变异是已知的，可以鉴定出保守的核苷酸区段(stretch)并用于引物设计。然而，一些物种(如RNA病毒)中的优选的保守区段，例如人丙型肝炎病毒部分编码区域，有时候太小而不能用于设计有效的引物。另外，甚至这些保守的片段也具有突变的倾向并不断地产生未知的多态性。这在快速分裂的生物体如病毒和细菌中最为显著，造成引物杂交的效率降低。结果是可能不发生扩增，其在例如常规诊断中是非常不受欢迎的，因为假阴性结果可以对有关患者造成严重后果。同样，在定量测定中，靶中的序列变异(多态性)可以导致对其定量过低(under-quantification)。

另外，扩增的靶序列和用于检测的探针之间的序列差异还降低检测的效率。对具有多态性的靶的检测因此不如对与探针共有序列完全匹配的靶的检测那样好。

文献EP-A-1.426.448涉及一种降低序列变异在诊断杂交测定中的影响的方法，所述诊断杂交测定使用核酸探针检测扩增的核酸分析物。其在于导入一个或多个的具有增加亲和力的修饰的核苷酸，更具体地是在分子信标环上导入。因为探针对多态分析物的亲和力增加了，所以降低了对多态性的敏感性。

尽管如此，该方法是探针专用的，并且没有克服引物与包含至少一个核苷酸变异的靶的错配问题。此外，关于探针的设计，该建议的解决方案需要修饰核苷酸，昂贵并需要特别的制造过程。

文献EP-B-0.246.864涉及用于区别可替换核苷酸序列的方法，其中使用两个核苷酸探针并和互补靶序列形成分裂探针杂交物。这样的探针使得靶序列中潜在的错配位于所述探针之间。

如上面文献所述，该方法的一个缺点是其仅专用于探针而不适用于引物。此外，该方法需要使用和设计两个探针。

因此，明显地需要一种扩增方法，其更不易于受到靶序列的杂交片段中的突变或遗传学变异的影响。

发明概述

本发明提供引物和/或探针，其是在均质测定中降低对序列变异依赖性的具有非常多用途的工具。根据第一实施方案，本发明提供设计为用于扩增靶核酸序列的引物，该靶序列含有至少一个变异，定义为称作基因型变异的一个非保守核苷酸，或定义为同一种基因型内的一个核苷酸变异，其中所述引物包含与其靶序列互补的核酸序列，但至少一个与所述变异互补的碱基除外，其不存在于引物中。

在一个具体的实施方案中，引物与含有至少两个变异的靶互补，其中所述变异彼此相邻。