[发明专利]酵母中提高的异源Fe-S酶活性

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请涉及并要求2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,801和2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,806的优先权。每一专利的全文均以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及工业微生物学领域和其活性需要铁-硫簇的蛋白质的表达。更具体地讲，通过使特定宿主基因失活，提高了异源Fe-S(铁-硫)蛋白活性在酵母细胞中的表达。

背景技术

改造酵母以用于商业产品的发酵生产，是一个活跃的和正在成长中的领域。为了某些产品的生物合成而加以改造的酶途径，包括那些其活性需要铁-硫(Fe-S)簇的结合的酶。二羟酸脱水酶(DHAD)是一个例子。DHAD是生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)的天然存在的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产，提高DHAD活性的表达是合乎期望的。此外，2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的DHAD催化的转化是共同未决的美国专利公布US 20070092957A1中所公开的多个异丁醇生物合成途径中的共同步骤。本文公开的是用于异丁醇生产的重组微生物的设计，异丁醇作为燃料添加剂是有用的，并且其使用可减少对石油化学燃料的需求。

在共同未决的美国专利公布US 2007-0292927A1中所公开的用于生产2-丁酮和2-丁醇的生物合成途径中，二醇脱水酶提供了酶活性。美国专利公布US20090155870公开的丁二醇脱水酶因其辅酶B-12非依赖性而对这一途径的表达是有用的。美国专利公布US20090155870还公开了不依赖B12的丁二醇脱水酶活性所必需的二醇脱水酶再激活酶，其中所述二醇脱水酶再激活酶是Fe-S簇蛋白质。2-丁酮，也叫甲基乙基酮(MEK)，是广泛使用的溶剂、萃取剂和氧化反应的活化剂，也是2-丁醇化学合成的底物。2-丁醇作为燃料添加剂是有用的，其使用可减少对石油化学燃料的需求。

就包括了包含Fe-S簇的酶的途径中合成的化合物的生产改进而言，提供能在所关注的生产宿主中表达高水平的此种酶活性的宿主细胞是合乎期望的。虽然许多商品化的相关细菌和酵母能表达包含Fe-S簇的蛋白质的活性，但此类活性的水平远低于商业上可用于增强引入的生物合成途径的水平。因此，需要发现能够以高至足以增强引入的、具有Fe-S需求的途径的水平来表达包含Fe-S簇的蛋白质的活性的宿主细胞。由于对Fe-S簇的需求(这种需求涉及可用性和Fe-S簇向脱辅基蛋白中的正确装载)，包含Fe-S簇的异源酶的功能性高表达的获得是成问题的。

发明概述

本文提供了包含至少一种异源Fe-S簇蛋白质的重组酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主中至少一种内源Fe-S簇蛋白质的表达降低。

所述重组酵母细胞可在适当条件下生长，以生产包括异丁醇、2-丁醇和2-丁酮在内的产品。

在一个方面，所述重组酵母细胞在编码所述至少一种内源Fe-S簇蛋白质的基因中包含损坏。

在另一方面，所述内源Fe-S簇蛋白质选自二羟酸脱水酶、异丙基苹果酸脱水酶、亚硫酸盐还原酶、谷氨酸脱氢酶、生物素合酶、乌头酸酶、同型乌头酸酶、硫辛酸合酶、成熟铁氧化还原蛋白、NADH泛醌氧化还原酶、琥珀酸脱氢酶、泛醌醇-细胞色素-c还原酶、ABC蛋白Rli1、核苷三磷酸酶Nbp35和氢化酶样蛋白质。

在另一方面，所述酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。

在另一方面，所述内源Fe-S蛋白质在线粒体中表达，并且在另一个实施方案中，所述内源Fe-S簇蛋白质具有选自下列的活性：二羟酸脱水酶和异丙基苹果酸脱水酶活性。

在另一方面，所述宿主细胞属于表达编码多肽的基因的糖酵母属，其中所述多肽具有如SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列。