[发明专利]区分酵母菌株和/或测定酵母菌株的遗传稳定性的新颖方法及其使用

说明书

技术领域

本发明涉及区分酵母菌株的方法和测定酵母菌株的遗传稳定性的方法，以及这些方法的使用和实施这些方法的试剂套件。

背景技术

酵母菌的鉴定在多个领域是重要的，包括从临床感染和食品污染物的鉴定到控制商业上用于生产啤酒、葡萄酒、蒸馏物、醇基生物燃料以及食品的酵母菌，所述食品生产指例如面包制作、酱油生产或天然补充剂和益生菌的生产。这些应用中的每个应用都需要一种或多种特定类型的酵母菌，并且选择和控制用于每种工序中的酵母菌对于产物的质量与一致性是极其重要的。

用于特定工序的酵母菌的一致性对于该工序所产生的产物的质量是具关键性的，因此制造商竭尽全力地控制所使用的酵母菌。例如，在酿造业中，公司使用专有的酵母菌株，将特定品牌所具有的特征给予其每一产物。因此，以无污染的纯净形式保存和使用这些专有的酵母菌株是至关重要的。

为保持酵母菌的完整性，通常在高度控制的条件下把酵母菌主样本贮存在被称为库的设施内。万一实际使用的该批酵母菌证实被污染，这就提供了标准的酵母菌源。用于发酵的酵母菌通常从小样本的增殖而获得，然后将其在新鲜时或干燥后用于重新构建和以后的使用。

在增殖过程中，酵母菌有可能改变其特征或受到污染。尽管培殖箱中的生长条件是受到高度控制的，确保了可引起突变的任何应激被保持在最小且受到污染的风险很小，但是也不能完全地消除突变和污染。可使用不同的生产方法：从培殖箱连续性抽样并将其用于发酵，或将一次发酵的成批增殖酵母菌移走、保存并用于后来的发酵。显然，酵母菌在全发酵法的过程期间突变或受到污染比在受控增殖期间突变或受到污染的可能性更大，但两种方法都有一些风险。在两种情况下都重要的是确保用于发酵的酵母菌是对的酵母菌并且其不含污染物。

各种酵母菌不同的程度通常是很小的，其鉴定非常困难，而现有的方法太慢，无法有助于发酵的日常监测。

目前，使用了多种技术来验证酵母菌株的一致性；然而，这些技术是费时的，并且不能被大多数例如酿造厂的使用酵母发酵的生产商，例如酿造厂内部运用。尤其与酿造业有关，在酿造师开始在发酵系统中使用酵母菌株之前就知道该菌株的验证研究结果并不常见。因此，发酵可在识别到任何污染或错误之前已在进行，这具有很大的风险。这清楚意味着成本的显著提高。在例如其他酒精饮料的生产中，还有在生物燃料的生产中的其他发酵工序都存有类似情况。

发明内容

因此，需要有将允许用于发酵系统的酵母菌株在使用之前被快速验证的酵母菌鉴定方法。

按照第一方面，本发明提供了测定样本中的酵母菌株的方法，其包括：

-从样本中的酵母菌获得核酸；

-将所述核酸进行两个或更多靶序列的筛查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区。

-从筛查结果断定样本中的酵母菌株。

优选地，使用PCR(聚合酶链式反应)来实施本发明的筛查步骤，以扩增从酵母菌样本获得的核酸中的所述两个或更多靶序列(如存在)。优选地，使用针对各所述靶序列的引物或引物对来进行所述PCR。优选地，对于每一个所筛查的靶序列都使用引物对。所述PCR可为实时PCR。可以解离曲线来测定是否扩增了正确的产物。

或者，可利用一个或更多的探针来测定有否存在着所述两个或更多的靶序列。可将所述一个或更多的探针标记。

优选地，通过探测有否存在着来自PCR反应的扩增产物来断定核酸样本中有否存在着靶序列。这种探测可利用凝胶电泳法做到。当测定有否存在着某特定靶序列时，除了考虑有否存在着扩增产物，亦可考虑所述扩增产物的大小和/或序列。

优选地，在本发明的方法中，所述靶序列至少其中之一包括至少一个非线粒体基因的整体或部分，或者包括与至少一个非线粒体基因相关的侧翼区。

所述非线粒体基因和/或其侧翼区可为编码选自包括酵母细胞壁相关的蛋白、与糖类代谢相关的蛋白、线粒体相关蛋白以及与酵母应激有关的转录因子和蛋白的群组中的蛋白的基因。

在本发明的一个实施例中，仅需要把线粒体基因和/或其侧翼区用作靶序列。例如，能够仅基于其线粒体DNA把用来生产麦酒(ale)的酵母与用来生产储藏啤酒(lager)的酵母相区别。同样，能够仅基于所述线粒体DNA中的靶序列把很多野生酵母从各种酵母区别出来。然而，对于另外一些酵母菌株来说，优选的是还使用染色体基因和/或其侧翼区来区别菌株。例如区别各种的储藏啤酒酵母菌株。