[发明专利]宿主、转化体及其制造方法、以及含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及宿主、转化体及其制造方法、以及含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。

背景技术

真核生物中的分泌性蛋白质等的糖基化是翻译后修饰中的重要过程之一，由与内质网、高尔基体相关的各种酶来管理。通过糖基化与蛋白质结合的糖链由甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基葡糖胺等形成。与蛋白质结合的糖链有结合在天冬氨酸残基的酰胺基的氮原子上的N-糖苷型糖链和结合在丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基的氧原子上的O-糖苷型糖链这两种。该糖链被认为影响着蛋白质的稳定性的赋予以及与细胞的相互作用。因此，为了制造医药品，尝试着开发用于制造结合有N-糖苷型糖链的蛋白质的技术(例如参照专利文献1和2)。

对于N-糖苷型糖链已积累了各种认识，但对于O-糖苷型糖链的认识较少。通常，在机体内生成结合有具有各种结构的O-糖苷型糖链的蛋白质，特别是在医药品的制造中，将结合于蛋白质的糖链的结构控制为特定的结构是很重要的。于是，对于具有O-糖苷型糖链的蛋白质，也要求开发出以高生产性制造具有特定的糖链结构的蛋白质的技术。

作为以高生产性制造目标蛋白质的方法，广泛采用的是使用导入有编码目标异源蛋白质(宿主本身不产生的蛋白质)的基因的转化体的基因工程制造方法。认为在制造来源于真核生物的蛋白质时，宿主最好使用作为真核生物的微生物，从不含对人体造成不良影响的物质的角度来看，多使用酵母。其中，已知与Saccharomyces cerevisiae(下称酿酒酵母)等出芽酵母相比，作为裂殖酵母的Schizosaccharomyces pombe(下称粟酒裂殖酵母)的细胞周期和染色体结构、RNA剪接等与动物细胞更为相似，认为所生成的蛋白质的翻译后修饰也与动物细胞更为接近。

酿酒酵母中的O-糖苷型糖链的合成由甘露糖通过PMT基因家族所编码的O-甘露糖基转移酶与蛋白质的丝氨酸残基或苏氨酸残基的氧结合而引发(参照非专利文献1和2)。随后，KTR基因家族所编码的α1，2-甘露糖基转移酶和MNN1基因家族所编码的α1，3-甘露糖基转移酶参与糖链的延伸(参照非专利文献3)。

另一方面，对于粟酒裂殖酵母，参与O-糖苷型糖链的延伸的基因尚未确定。

对于使用粟酒裂殖酵母的异源蛋白质的制造，已开发出在粟酒裂殖酵母中起作用的启动子和分泌信号基因、多克隆载体等。但是，参与粟酒裂殖酵母中的O-糖苷型糖链的糖链修饰的基因尚不清楚，因此至今为止无法控制O-糖苷型糖链的结构。

由于以上原因，希望开发出用粟酒裂殖酵母制造具有特定的O-糖苷型糖链的异源蛋白质的方法。

专利文献1：日本专利特表2004-501642号公报

专利文献2：日本专利特表2005-514021号公报

非专利文献1：Strahl-Bolsinger S，Gentzsch M和Tanner W，Biochim Biophys Acta，1426，297-307(1999).

非专利文献2：Girrbach V和Strahl S，J Biol Chem，278，12554-12562(2003)

非专利文献3：Lussier M，Sdicu M和Bussey H，Biochim Biophys Acta，1426，323-334(1999)

发明的揭示

于是，本发明的目的在于提供一种转化体及该转化体的制造方法，所述转化体可使用粟酒裂殖酵母作为宿主来获得具有将糖链结构控制为O-Man-Gal(异源蛋白质的氧原子上依次结合有甘露糖、半乳糖的糖链)双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。本发明的目的也在于提供用于获得该转化体的粟酒裂殖酵母宿主。

本发明的目的还在于提供使用所述转化体的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。

本发明的宿主是由omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母构成的宿主，用于通过基因工程方法使编码异源蛋白质的基因表达，再使糖链结合于所表达的异源蛋白质，从而生成具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。

本发明的转化体以omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作为宿主，包含编码异源蛋白质的基因。

本发明的转化体较好是还包含编码在所述粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信号的基因，该基因结合于编码所述异源蛋白质的基因的5’末端。

本发明的转化体中，较好是与所述异源蛋白质相对应的野生型蛋白质是具有O-糖苷型糖链的蛋白质。