[发明专利]从脂肪组织获得细胞群的方法

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求2008年10月17日提交的美国临时专利申请no.61/106353的优先权，所述临时专利申请以其全文引为参考。

发明背景

使用干细胞，通过将这些细胞给药到疾病位点并希望细胞在那里再生或修复组织以治疗疾病，是科学家和医生的目标。尽管间充质干细胞(也称为基质干细胞)表现出强大的增殖能力和产生结缔组织系(骨骼、软骨、肌腱、脂肪等)后代的能力，但收获适于临床使用的数量的这些细胞可能是困难的。

已经显示，人类脂肪组织含有具有强大增殖能力以及分化成多种细胞系能力的细胞群。这些细胞被称为脂肪组织来源的干细胞(ADSC)或脂肪基质干细胞(ASC)，通常与间充质干细胞(也称为骨髓基质细胞)相似，尽管不完全相同。Fraser等，Methods in Molec Biol 449：59-67(2008)。

尽管从脂肪组织获得细胞例如ADSC的方法在本技术领域中是已知的，但这些方法的效率仍有待优化，以便从少量脂肪组织获得最大量的活细胞。例如Fraser等，2008，同上，公开了从脂肪组织获得细胞，其中仅从组织中分离到2x 10⁴个细胞，而对于灌输到患者中用于治疗目的来说，典型需要约10⁷-10⁹个细胞(国际专利申请公开号WO 03/080801)。此外，许多这些方法出于细胞增殖和扩增的目的，包含从脂肪组织所获细胞的铺板或组织培养步骤。因为细胞表型随组织培养的时间而变，因此需要仅含少量或不含体外组织培养步骤的获得大量细胞的方法。

因此，在本技术领域中，对于从少量脂肪组织有效获得大量新鲜分离的活细胞的优化方法，存在着需求。对于从来自脂肪组织的细胞产物富集目标细胞例如CD34阳性细胞的方法，也有需求。

发明简述

本发明提供了从少量脂肪组织有效获得大量新鲜分离的活细胞的方法，以及富集或选择在其中发现的靶细胞群的方法。

在某些实施方案中，从脂肪组织获得细胞群的方法包括将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度为至少200U/ml溶液并且不超过319U/ml溶液。在某些实施方案中，方法不含任何扩增所获细胞群的步骤。在某些情况下，方法还包括用于从脂肪组织获得靶细胞富集群的正向或反向选择步骤。就此而言，本发明还提供从脂肪组织获得靶细胞富集群的方法，所述方法包含从脂肪组织获得细胞群，以及将细胞群在包含第一抗体的第二种溶液中温育，所述第一抗体将细胞群分离成包含靶细胞的亚群和基本上不含靶细胞的亚群，由此获得靶细胞富集群。

本发明还提供按照本文描述的方法获得的细胞群(例如靶细胞富集群)。

本发明还提供了包含从脂肪组织获得的细胞群(例如靶细胞富集群)的药物组合物的相关制备方法、按照这些方法制备的药物组合物以及在治疗患者疾病或病症的方法中使用药物组合物的方法。

附图说明

图1显示了基于抗体的正向选择技术的示意图，其中靶细胞(或用“S”标记的所选细胞)是CD34阳性细胞，其是脂肪组织的基质血管级分(SVF)的一部分。第一抗体(抗CD34mAb)与CD34阳性细胞(用“S”标记)结合，第二抗体(SAM Ig抗体)接下来与第一抗体结合。第二抗体结合到顺磁性珠子上，并使用磁体从SVF组分中除去免疫复合物。为了释放CD34阳性细胞，向复合物加入释放肽(显示成三角形)并进行第一抗体与靶细胞上的CD34抗原的置换，以提供纯化的CD34阳性细胞群。

图2显示了如本文所述对脂肪组织进行消化后获得的细胞的多彩流式细胞分析图。显示了亮和暗的CD34ASC和MSC以及淋巴细胞、内皮细胞和造血祖细胞。碎片或死细胞也是一个门控群。

图3显示了图1所概述的选择前(左图)和选择后(右图)SVF的流式细胞分析图。显示了CD34亮/CD45-、CD34亮/CD45+、CD34暗/CD45-群。

图4显示了与图2相同的流式细胞分析数据，只是标出了群A-C。

图5显示了激光多普勒成像时间过程图。如本文中所述，数据表示成在只给药PBS、给药未选择细胞或CD34阳性选择细胞的小鼠中，缺血肢与不缺血肢中相比的灌注百分率。

发明详述

本发明提供了从脂肪组织获得细胞群的方法。方法包含将脂肪组织在包含酶的溶液中温育，所述酶的浓度被优化以获得每ml脂肪组织最大数量细胞的释放而不牺牲细胞生活力。

脂肪组织