[发明专利]大范围核酸酶重组系统

权利要求书

1.一组基因构建体，其包括：

a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

A1-A2-A3-A4-A5(i)

其中A1是第一启动子；A2是第一同源部分；A3是大范围核酸酶切割位点；A4是第一标记基因；A5是第二同源部分；并且其中构建体(i)被设置成稳定整合进至少一个靶细胞的基因组中；

b)构建体(ii)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

A2’-B1-B2-B3-B4-A5’(ii)

其中A2’包含所述第一同源部分A2的一部分；B1为与所述第一标记基因不同的第二标记基因；B2是第二启动子；B3是多克隆位点；B4是第三启动子；A5’包含所述第二同源部分A5的一部分；

c)至少一种构建体，其选自包含以下的组：

构建体(iii)或(iv)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

C1-C2(iii)；

C3(iv)；或

构建体(v)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质：

C4(v)；

其中C1是第四启动子；C2是大范围核酸酶的开放阅读框(ORF)；C3是所述大范围核酸酶的信使RNA(mRNA)形式；C4是所述大范围核酸酶的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(iii)、(iv)或(v)的所述大范围核酸酶识别并切割A3；并且其中构建体(iii)、(iv)或(v)被设置成与构建体(ii)共转染进所述至少一个靶细胞中。

2.权利要求1的构建体组，其中所述构建体(ii)之组分A2’和A5’分别包含所述构建体(i)之组分A2和A5的至少200bp且不多于6000bp。

3.权利要求1或2的构建体组，其中所述构建体(ii)之组分A2’和A5’分别包含所述构建体(i)之组分A2和A5的至少1000bp且不多于2000bp。

4.权利要求1至3中任一项的构建体组，其中所述组分A5编码标记基因或其部分。

5.权利要求1至4中任一项的基因构建体组，其中所述组分A5’包含3’端缺失的所述A5。

6.权利要求1至5中任一项的基因构建体组，其中所述构建体(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中每一个的所述组分选自以下组：

7.权利要求1至6中任一项的基因构建体组，其中构建体(i)包含SEQ ID NO：6。

8.权利要求1至7中任一项的基因构建体组，其中构建体(ii)包含SEQ ID NO：22。

9.权利要求1至8中任一项的基因构建体组，其中构建体(iii)包含SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39。

10.权利要求1至9中任一项的基因构建体组，其中构建体(iv)包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35。

11.权利要求1至10中任一项的基因构建体组，其中构建体(v)包含细胞透过肽，特别是其中所述细胞透过肽选自包含以下的组：SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57。

12.用于将编码GOI的序列引入至少一个细胞的试剂盒，其包含权利要求1至11中任一项的基因构建体组；和采用所述基因构建体组产生转化细胞的说明。

13.权利要求12的试剂盒，其还包含由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：54组成的构建体(vi)。

14.权利要求12或13的试剂盒，其还包含稳定转化了所述构建体(i)的至少一个细胞。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述至少一个细胞选自包含以下的组：CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞。