[发明专利]大范围核酸酶重组系统

说明书

本发明涉及一组基因构建体，其使得可以在基因组的固定位置高效地并可重复性地引入特定的核苷酸序列。本发明还涉及使用这些构建体的方法和试剂盒形式的这些材料。

自从25年多以前在酵母中首次进行基因靶向实验以来(1，2)，同源重组已被用来插入、替换或删除多种细胞中的基因组序列(3-5)。然而，在哺乳动物细胞中靶向事件的发生频率非常低。同源重组的频率可通过所靶向基因座中特异性DNA双链断裂(doule-strand break，DSB)而显著提高(6，7)。可采用大范围核酸酶(Meganuclease)产生这种DSB，所述大范围核酸酶是识别大的DNA靶向位点(＞12bp)的序列特异核酸内切酶。这些蛋白质可切割独特的染色体序列而不影响基因组的整体完整性。天然的大范围核酸酶主要由归巢核酸内切酶(homing endonuclease)所代表，所谓归巢核酸内切酶是在真核动物、细菌和古细菌中发现的广泛存在的蛋白质类别(8)。对I-SceI和HO归巢核酸内切酶的早期研究已表明这些蛋白质的切割活性如何在活细胞中引发同源重组(homologous recombination，HR)事件，并证实染色体DSB的重组产生特性(9，10)。从那时起，已经在细菌(11)、哺乳动物细胞(6，7，12-14)、小鼠(15)和植物(16，17)中成功地将大范围核酸酶诱导的重组用于基因组工程目的。

基因插入可例如用于将目的基因引入特定基因座，以用于产生异源蛋白质。目前的重组治疗蛋白质大部分在稳定转染目的基因的哺乳动物细胞(如CHO、小鼠SP2/0和NS0细胞或人PerC.6细胞系)中产生(18)。在筛选高表达克隆的过程中，蛋白质表达的水平和稳定性是两个主要的标准。对于改善筛选工作来说，在各克隆之间获得可重复性的结果是有利的。这些原则也适用于产生用于筛选特定药物靶标的细胞。同样的原则也可适用于在相同基因组背景下表达的多种基因，以在所得细胞系之间进行比较性研究和分析。这样的细胞系还可在筛选程序中被化合物文库作用。

然而，目前没有在异源序列插入/缺失可容易进行确定的基因座处引发DSB的方法。

本发明人开发了一组新的基因构建体，其使得在其它相同遗传背景的细胞系中可重复性地整合和表达目的基因(gene of interest，GOI)或一系列基因。

根据本发明的第一方面，提供了一组基因构建体，其包括：

a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

A1-A2-A3-A4-A5(i)

其中A1是第一启动子；A2是第一同源部分；A3是大范围核酸酶切割位点；A4是第一标记基因；A5是第二同源部分；并且其中构建体(i)被设置成稳定整合进至少一个靶细胞的基因组中；

b)构建体(ii)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

A2’-B1-B2-B3-B4-A5’(ii)

其中A2’包含所述第一同源部分A2的一部分；B1为与所述第一标记基因不同的第二标记基因；B2是第二启动子；B3是多克隆位点；B4是第三启动子；A5’包含所述第二同源部分A5的一部分；

c)至少一种构建体，其选自包含以下的组：

构建体(iii)或(iv)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码：

C1-C2(iii)；

C3(iv)；或

构建体(v)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质：

C4(v)；

其中C1是第四启动子；C2是大范围核酸酶的开放阅读框(ORF)；C3是所述大范围核酸酶的信使RNA(mRNA)形式；C4是所述大范围核酸酶的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(iii)、(iv)或(v)的所述大范围核酸酶识别并切割A3；并且其中构建体(iii)、(iv)或(v)被设置成与构建体(ii)共转染进所述至少一个靶细胞中。

该基因构建体系统使得可以在经改造的细胞中的特定基因组位置整合和表达GOI。通过大范围核酸酶诱导的重组将包含可被克隆入B3部分的GOI的构建体(ii)在对应于构建体(i)之基因组整合位置的特定位点整合入基因组。所述整合事件以极高频率发生并非常特异。

每个基因构建体由以上必需组分(A1至A5、A2’和A5’、B1至B4以及C1至C2)组成，但在这些之间可存在其它核苷酸序列，前提是它们不影响本文定义的所请求保护之组分的特性。