[发明专利]抗微生物剂

说明书

本发明涉及具有改进的针对革兰氏阴性细菌的抗菌作用的修饰的细胞内溶素变体。所述修饰的细胞内溶素变体包含细胞内溶素以及融合于该细胞内溶素的阳离子肽，从而增强了所述细胞内溶素的阳离子性(cationicity)。本发明还涉及用包含下述核酸序列的核酸转化的微生物，所述核酸序列编码具有增强的阳离子性的修饰的细胞内溶素。本发明还涉及使用下述微生物作为生产生物产生细胞内溶素变体的方法，所述微生物经编码根据本发明的细胞内溶素变体的核酸转化。

具体而言，本发明涉及下述细胞内溶素变体，所述变体包含融合了具有膜或LPS破坏活性的肽段(peptide stretch)的细胞内溶素。而且，本发明涉及编码所述修饰的细胞内溶素变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及用于产生所述细胞内溶素变体的方法。此外，本发明涉及所述修饰的细胞内溶素变体用作药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，用作诊断手段、消毒剂或作为美容用物质。本发明还涉及去除或减少或防止食品或食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染。此外，本发明涉及所述细胞内溶素变体作为诊断手段在医学、食物或饲料或环境诊断中的用途。最后，本发明涉及包含所述修饰的细胞内溶素变体的药物组合物。

细胞内溶素为噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β(1，4)-糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知，由于抗生素的成功和主宰地位，忽略了这些酶作为抗细菌剂的用途。仅在多重抗生素抗性细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概念方才受到注意。出现了令人瞩目的开发全新类型的抗细菌剂的需求，且用作酶抗生素(enzybiotics)(“酶”和“抗生素”的组合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。在2001年，Fischetti及其同事首次阐明了噬菌体Cl细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等，2001)。从此，多份公开物确立了细胞内溶素作为控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌的有吸引力和补充的替代手段。接着，证明了针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Loeffler等，2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(Schuch等，2002)、无乳链球菌(S.agalactiae)(Cheng等，2005)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Rashel等，2007)的不同细胞内溶素作为酶抗生素的效力。现在，细胞内溶素疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌由于外膜屏蔽细胞内溶素接近肽聚糖而对细胞内溶素的外源作用不敏感。这一点现在阻止了细胞内溶素的有效范围扩张至重要的革兰氏阴性病原体。

革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要由单一糖脂——脂多糖(LPS)构成的外侧单分子层组成。在细菌界，LPS结构具有广阔的多样性，且LPS结构可响应主导的环境条件而受到修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg²⁺、Ca²⁺)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用达成。因此，阳离子结合位点对于外膜的完整性是必需的(Vaara，1992)。聚阳离子剂如聚-L-赖氨酸聚合物(至少20个残基的)通过置换这些起稳定作用的二价阳离子来增加外膜的渗透性。此外，它们施加了所谓“自促摄入(self-promoted uptake)”机理(Hancock和Wong，1984)。由于其体积庞大，其破坏了外膜的正常屏障功能，并产生暂时的裂缝，从而促进其自身的摄入(Vaara和Vaara，1983)。此外，由于缺乏不饱和脂肪酸所致，脂质A疏水部分的密集而有序的包装形成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透，并赋予外膜(OM)额外的稳定性。

然而，微生物对抗生素抗性的增加对治疗愈来愈多的细菌导致的感染造成了困难。具体的困难出现于由革兰氏阴性细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)导致的感染。