[发明专利]核酸测序的方法和试剂盒

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及用于测序目标核酸(DNA，RNA，cDNA等)分子的分子生物学方法、仪器和试剂，从而能够进行既高度平行又长的“读出长度”的核苷酸测序。

相关技术的描述

DNA是由称作核苷酸的单元组成的长聚合物。该DNA聚合物是单一单元的长链，其一起形成称作核酸的分子。核苷酸可以是四种亚单元(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T))之一，当在聚合物中时，它们可携带细胞中的遗传信息。DNA包括两个长核苷酸链，其包括四种不同核苷酸碱基(例如AGTCATCGTAGCT...等)，具有通过酯键连接起来的糖和磷酸基的主链，缠绕成双螺旋并通过互补核苷酸之间的氢键进行连接(A与相反链中的T及C与相反链中的G形成氢键)。沿着主链的核苷酸碱基序列可确定个体的遗传特征。

分子生物学的中心法则一般描述生物信息的正常流动：DNA可复制为DNA，DNA中的遗传信息可“转录”为mRNA，mRNA中的信息可在一个称为翻译的过程中翻译得到蛋白质，在该过程中使蛋白质亚单元(氨基酸)按照tRNA(每个tRNA携带由其序列决定的特定的氨基酸)结合mRNA的顺序(由该mRNA的序列和因此由该DNA规定)足够接近以键合。

发明概述

根据本发明的实施方案公开了测序目标多核苷酸的方法。该方法包括：在测定区内提供灵敏检测纳米结构，其在测定区内产生与该纳米结构的性质相关的信号，其中该纳米结构偶联到检测该信号的设备；在测定区内使引物与目标多核苷酸的5′末端区杂交，从而所产生的引物-目标多核苷酸可操作地偶联到(operably coupled)该纳米结构；在如下条件下向测定区内该引物-目标多核苷酸添加一种或多种核苷酸和聚合酶，所述条件是，当至少一种所添加的核苷酸与该引物下游的目标多核苷酸上的碱基互补时，支持新生链的聚合的条件；以及在测定区内检测添加到新生链的至少一种核苷酸所特有的信号的变化。

在该方法的优选实施方案中，该纳米结构的性质是电荷。

在该方法的某些实施方案中，所添加的核苷酸还包括电荷物质(charge mass)报道结构部分(reporter moiety)和接头，该电荷物质报道结构部分包括高电荷物质结构部分。在一些实施方案中，该电荷物质报道结构部分设定为可除去的。在一些实施方案中，该电荷物质报道结构部分在检测信号后从所添加的核苷酸中除去。在一些其他实施方案中，该电荷物质报道结构部分设定为不影响新生链通过聚合酶的聚合。在其他实施方案中，该电荷物质报道结构部分设定为从该新生链突出(protrude out)从而达到该灵敏检测纳米结构。

在一些实施方案中，该高电荷物质结构部分包括芳香族的和/或脂肪族的骨架，该骨架包括叔氨基、醇式羟基、酚式羟基、或其任何组合中的一种或多种。该高电荷物质结构部分可包括一种或多种下述基团或其衍生物：

在该方法的某些实施方案中，接头包括具有下述通式的分子：

H₂N-L-NH₂

其中L包括直链或支链，该直链或支链包括烷基、烷氧基、或其组合。

在一些实施方案中，L可包括直链，该直链包括烷基、烷氧基、或其组合。该直链中的碳原子数可以是1至100。

在一些实施方案中，所添加的核苷酸也可以在5′磷酸处包括可断开的帽分子，从而阻止另一个核苷酸的添加，直到该可断开的帽被除去为止。在一些其他实施方案中，接头可结合到所添加的核苷酸的5′磷酸基，由此充当帽。

在该方法的变形中，多于一个核苷酸可被添加到测定区，但是直至添加到新生链的前一个核苷酸所特有的信号被检测之后，后继的核苷酸才被添加到该新生链。

在一些实施方案中，该引物-目标多核苷酸和该纳米结构之间可操作的偶联包括将该引物固定到该灵敏检测纳米结构。在其它实施方案中，该引物-目标多核苷酸和该纳米结构之间可操作的偶联包括将该目标多核苷酸固定到该灵敏检测纳米结构。

在某些实施方案中，使该引物与目标多核苷酸的5′末端区杂交包括使该引物与已经连接到该目标多核苷酸5′末端的寡核苷酸杂交。