[发明专利]用于微生物快速生长和检测的组合物和方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于在待测样本中，检测采自微生物尤其致病微生物的特定物质的方法。本发明还涉及用于该微生物快速生长使得与当前的方法相比，明显早地检测成为可能的组合物和方法。

发明背景

由于食物产品从本质上是生物的，其能够支持多种微生物的生长。根据统计，在美国每年发生七千六百万例食源性疾病，在医疗护理和生产力降低方面花费六十五亿到349亿美元的(Buzby和Roberts，1997；Mead等人，1999)。据统计在欧洲沙门氏菌属的经济和卫生服务的花费在六亿两千万到三十亿欧元之间(David Byrne，European Commissioner for health and consumer protection，2000)。

沙门氏菌属，属，弯曲杆菌属，大肠杆菌O157:H7以及志贺氏菌属是形成大多数食源性疾病案例的原因。例如，沙门氏菌属和李斯特菌属单独地对分别为31％和28％的食物相关的死亡负责(Mead等人1999)，而在日本，在1981年到1995年之间，沙门氏菌病占总的食源性疾病爆发的14％以上(Lee等人，2001)。实际上，根据估计细菌是多达60％的需要住院的食源性疾病的病例的病因。因此，对微生物污染产品的低效率的及慢速的检测造成的延迟是造成浪费的最大因素之一。按照当前的检测方法，生产商必须为微生物繁殖结果等待三到七天。该延迟所产生的成本是显著的——降低了供应链的效率，占用库存并且增加损坏。

不适当的或者不完善的检测的成本可能是昂贵的，如果不会带来更多问题的话。例如，1999年Sara Lee在其食物被认为与李斯特氏菌属爆发有关之后，与其BiI Mar Foods单位的三千五百万磅热狗和熟肉的召回有关的花费估计有七千六百万美元。根据《The Scotsman》，2006年Cadbury Schweppes在为沙门氏菌属污染巧克力的召回成本，广告，损失的收入以及随后对其生产操作的改进花费了估计有两千万英镑。更近的在2009年，美国花生公司，作为2008年经营收入估计有两千五百万美元的公司，在被确认是美国花生中一次较大的沙门氏菌爆发的源头之后，递交了破产请求。

因此，在食物、饲料和环境样品中检测致病性微生物如沙门氏菌属，志贺氏菌属和李斯特氏菌属的存在具有重大的经济意义。然而，用于该微生物检测的传统培养方法不仅是劳动力密集的，而且耗时。通常这样的方法基于已经使用超过五十年的标准步骤。

除此之外，致病性的微生物能够在环境中长期处于受严重的胁迫状态，所述的“活的非可培养状态(VNC)”或者“不能立即培养(NIC)”状态。该受严重的胁迫的微生物仅仅显示出弱的，通常在检测限上的代谢活性，并且其失去在非选择性平面皿培养基上形成聚落，或者在非选择性肉汤培养基中生长的能力(Reissbrodt等人，2002)。然而，当这种不可培养的聚落存在于食物和动物饲料中时，如果食用，其仍然可能导致疾病。由于这样受胁迫的微生物可能无法充分地活化以至于能够被检测，这带来了特别的问题。

因此，任意诊断中在进一步培养、铺板和检测之前通常包括旨在活化该细胞的额外的细胞培养步骤。因此，在非选择性的培养介质中预先富集对于传统的方法而言是关键的要素(Stephens等人，2000)。例如，沙门氏菌属的检测需要长达5天的数个培养阶段；分析通常包括富集步骤，从而活化“生病的”细菌，并且检测通常受到该富集肉汤和培养基的性能的限制。

因此，为了恢复来自潜在地含有异源的细菌种群的临床标本，食物和其他产品的微生物，可以使用三大类培养介质：(1)为初步分离目的的非选择性的介质；(2)富集肉汤以及(3)选择性的和/或分化性的琼脂糖。该介质的配方通常复杂，并且包括不仅抑制特定的细菌种类生长，也即它们是选择性的，同时也检测几种生物化学特性，所述的生物化学特性在对样品中存在的微生物进行早期鉴别是重要的，也即，它们是分化性的。为了进行合理的选择，微生物学家必须知道各个配方的成分以及所包括的各个化合物的目的及相对浓度。不幸的是，可得到的介质通常过于复杂，以及多种组分的效果和量通常很少为人所知。通常，所使用的介质与使用了几个世纪的介质是一样的，并可能是一开始为了完全不同的生物体开发的。例如，由于这些缺陷，当前对沙门氏菌属的检测率在15天内低于50％，以及在28天内低于90％(King，2009)。