[发明专利]制备T细胞的体系和方法

说明书

政府支持项目说明

本发明为政府支持项目，项目号NIH，资金号HL59412。政府对本发明具有一定的专利所有权。

相关应用交叉引用

本发明与2008年9月11日提交的美国临时申请61/096,240有关，且根据35USC 119的规定，本发明享有该临时申请的优先权。

简介

T细胞对哺乳动物免疫系统的建立具有举足轻重的作用。对于身患慢病毒感染或癌症的病人而言，其体内免疫系统常无法正常工作(1)。大规模生产用于治疗感染和癌症的T细胞一直广受人们的关注。体内扩张的抗原特异性淋巴细胞的自体移植受健康的功能性T细胞来源的限制(2)。异性抗原特异性效应T细胞的继承性转移受上述活性T细胞适用性的限制，且受移植物抗宿主病(GVHD)的影响(3)。因此，由成人骨髓(BM)衍生的体内CD34造血干细胞(HPC)合成大量抗原特异性T细胞有助于克服上述部分局限。

较前发表的合成人体T淋巴细胞，如上皮细胞的胸腺器官培养和三维培养体系的体内培养系统较为复杂，且难以操作(4-6)。这些体内培养体系表明了鼠和人体器官胚胎干细胞的早期T细胞分化(7，8)。近期报道了一种简单的T细胞发育培养体系，该体系使用可表达Notch配体的δ-1型1(OP9-DL1)鼠胚胎基质细胞，且上述细胞为分化胸腺细胞提供了一种均一的二维环境(9)。OP9-DL1培养体系可以支持从鼠的胚胎肝脏(10)、成人骨髓(BM)(11，12)和人体脐带血和儿童骨髓(13，14)中分离的原体分化。

使用OP9-DL1培养体系，由成人造血干细胞合成成熟T细胞的先例为数不多(13，15)。近期我们的研究发现使用慢病毒载体(LV)工程OP9-DL1(LmDL1)培养体系，成人骨髓提取的CD34造血干细胞，其T细胞生长速率较胚胎和血液慢(16)。已有原理验证研究对人体CD8T细胞受体(TCR)与OP9-DL1培养体系一起进入人体脐带血或胸腺造血干细胞的逆转录病毒药物转移进行了验证(17，18)。如没有成人T细胞发育体系从患者自身造血干细胞合成与成人白细胞抗原(HLA)匹配的T细胞，则上述应用需进行同种异基因移植(19)。

发明内容

本发明阐述了较前利用体内成人T细胞发育体系的至少三个局限性：preT细胞的有限扩展，双阳(DP)阶段的无效分化和缺乏正选择和谱系提交。本发明开发出一种可表达DL1，Flt3-L和/或IL-7的工程基质细胞的改进型体系，上述体系可提高CD34造血干细胞的preT细胞扩展。更为重要的是，本发明发现连续的IL-7信号可破坏未成熟的单阳(ISP)胸腺细胞进一步分化为双阳胸腺细胞，进而导致淋巴细胞功能发育不完全。正选择过程受IL-7受体(IL-7R)和TCR信号的影响较大。有趣的是，通过对IL-7R信号和进一步TCR结合的灼烧，CD4T细胞的正选择和谱系提交可在体内发生。此外，本发明发现这些CD4T细胞功能成熟。由成人造血干细胞合成功能性CD4T细胞的简单体内培养体系使得一系列变换免疫治疗方案成为可能。

附图说明

图1.慢病毒载体改性的鼠胚胎基质细胞系。(A)慢病毒载体结构。(B)ELISA分析LmDL1和LmDLFL7细胞引发的IL-7分泌。(C)鼠δ型-1(DL1)表面表达的流式细胞仪分析。(D)流式细胞仪分析慢病毒载体改性基质细胞系LmDL1-FL和LmDL1-FL7的Flt3L表达。

图2.慢病毒载体改性LmDL1-FL7基质细胞支持早期T淋巴细胞的扩张生长(A)培养在LmDL1上，且含有IL-7和Flt3L，或培养在LmDL1-FL7上的成人骨髓CD34⁺造血干细胞的T细胞生长动力学。如图所示，不同的培养天数下，从共培养体上取样以观察造血干细胞的生长，选用抗-CD4和抗-CD8抗体进行染色，并采用流式细胞仪进行分析。(B)培养在LmDL1上，含有IL-7和Flt3L，或培养在LmDL1-FL7上成人骨髓CD34+造血干细胞的CD3和TCRαβ表达动力学。(C)培养在LmDL1上，含有IL-7和Flt3L，或培养在LmDL1-FL7上的分化T细胞的繁殖曲线。(D)自42天共培养开始，经过两周抗-CD3/CD28刺激后的T细胞发育标记和核Ki67的流式细胞仪分析。采用PBMCs(未刺激)进行控制。