[发明专利]控制肺炎链球菌血清型19A多糖分子量的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过控制收获时间来增加分离的肺炎链球菌(Strdptococcus pneumoniae)血清型19A荚膜多糖的分子量的方法。

背景

在制备预防由肺炎链球菌(也称作肺炎球菌)生物体导致的侵袭性疾病的多价缀合的肺炎球菌疫苗中，使选定的肺炎链球菌血清型生长以提供产生疫苗所需的多糖。细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时通过加入脱氧胆酸钠或者另外的裂解剂诱导裂解。然后收获裂解物肉汤以进行下游的纯化并回收围绕细菌细胞的荚膜多糖。在与载体蛋白缀合后，所述多糖包含于最终的疫苗产物中，并赋予疫苗靶向群体对于选定的肺炎链球菌血清型的免疫力。

多糖大小是在每个批次制品中测定的质量属性，且必须适当控制。对于肺炎链球菌血清型19A多糖，多糖的大小受到例如发酵作用的pH、发酵温度和保持温度等参数的影响。此外，19A荚膜多糖在发酵/回收以及纯化过程中均可出现热降解，在扩大生产工艺以大规模制备19A荚膜多糖时，这对于成功处理和控制各种参数而言构成另一个挑战。

因此，需要从细胞肺炎链球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖的改良的方法。

发明简述

本发明提供了从肺炎链球菌细胞裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖的改良的方法。在一种方法中，将产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物发酵，发酵时间少于6小时，然后裂解细菌细胞，并收获荚膜多糖。因此，在本发明的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；3)裂解发酵培养物中的细菌细胞；以及4)从发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖，由此产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间少于5小时。在另一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间少于4小时。在另一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间在3小时到6小时之间。在另一个具体的实施方式中，分离的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量为至少480kDa。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括向产生肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的细菌细胞培养物提供CO₂。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)向所述发酵培养物提供CO₂；3)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；4)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；以及5)从发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖；由此产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在一具体的实施方式中，向发酵培养物提供CO₂包括在发酵培养物中加入碳酸氢根离子(HCO₃^-)，例如在发酵培养物中加入NaHCO₃(碳酸氢钠)。在进一步的实施方式中，向发酵培养物提供CO₂包括在发酵培养物中加入碳酸根离子(CO₃^2-)，例如在发酵培养物中加入Na₂CO₃(碳酸钠)。在另一实施方式中，向发酵培养物提供CO₂包括首先加入NaHCO₃其次加入Na₂CO₃。在另一个实施方式中，向发酵培养物提供CO₂包括用CO₂覆盖发酵培养物。在另一实施方式中，分离的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量为至少480kDa。

在另一实施方式中，本发明涉及含有高分子量的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液，其中所述溶液通过如上所述的任一方法制备。

附图简述

图1显示了来自3L规模实验室研究中的发酵期期间的光密度(OD)、碱和葡萄糖水平，其中使用Na₂CO₃作为滴定碱。为了绘图目的，以克数表示的碱除以10。

图2显示了来自3L规模实验室研究中的发酵期期间的光密度(OD)、碱和葡萄糖水平，其中使用NaOH作为滴定碱。为了绘图目的，以克数表示的碱除以10。

图3显示了对于交替Na₂CO₃或NaOH补料在不同pH调节下的总蛋白质和多糖结果。

图4显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的发酵收获时间的函数的分子量。