[发明专利]保持序列的DNA转化

说明书

发明领域

本发明涉及按照预定的核苷酸密码转化靶核酸分子的方法。随后可将转化的核酸用于测定靶分子的核苷酸序列。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)的规定要求在2008年10月29日提交的美国临时专利申请系列No：61/109,298的权益，该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术

第一参考人类基因组序列的开创性成就(国际人类基因组测序组织(International Human Genome Sequencing Consortium)Nature2001；490：860-921；Venter JC，Adams MD，Myers EW，Li PW，Mural RJ，Sutton GG等人Science 2001；291：1304-51)标志了其中基因组变异直接影响药物研发和药物治疗时代的开端。该新范例已滋生了对DNA测序的低成本且超快速的方法的需求。据认为，在不久的将来，执业医师将能够在开药方之前在临床环境下对个体患者的DNA进行常规分析。可对比其中记录了与任何药物相关的基因组信息的在线数据文库来检查获自个体的序列信息。

此外，可支付得起的测序技术将改观比较基因组学和分子生物学的研究，从而使得科学家快速测序来自细胞变异体的完整基因组。为了实现超快速且低成本的DNA测序，需要革命性的技术来取代基于Sanger的“双脱氧”方案(Shendure J，Mitra RD，Varma C，Church GM.Nat Rev Genet 2004；5：335-44)的经典方法。基于Sanger法的现代测序通常产生具有低质量的前15至40个碱基、不超过700至900个碱基的高质量区域和接着质量快速变差的余下序列的序列。

新型测序技术需要解决2个主要问题。第一，应当将样品大小减小至最小，从而使得能够从单个DNA分子或少量拷贝读出序列。第二，与现有最新技术相比，应当使读出速度增加数个数量级。近年来，纳米孔已被广泛用作灵敏的单生物分子检测器。已显示出，可电泳驱动单链DNA分子以单列的方式通过1.5-nm α-溶血素纳米孔。该方法称为DNA易位(Kasianowicz J，Brandin E，Branton D，Deamer D.Proc Natl Acad Sci USA 1996；93：13770-3；Akeson M，Branton D，Kasianowicz J，Brandin E，Deamer D.Biophys J 1999；77：3227-33；Meller A，Nivon L，Brandin E，Golovchenko J，Branton D.Proc Natl Acad Sci USA 2000；97：1079-84)。该领域中的推动理念之一是纳米孔可用于DNA序列的直接电子读出(Deamer DW，Akeson M.Tibtech 2000；18：147-50.)。然而，早期研究已指出，在纳米孔可被用于单分子测序之前必须解决若干突出的问题(Meller A等人(2000)，同上Meller A，Nivon L，Branton D.Phys Rev Lett 2001；86：3435-8)。具体来讲，快速的DNA易位速度和4种碱基类型的电信号之间的低反差已阻碍了单个核苷酸的分化。

纳米孔测序的主要优势是可使用纳米孔直接探测单个DNA分子而无需DNA分子的扩增，所述DNA分子的扩增是易错的、低通量的并且成本高。然而，目前纳米孔测序技术不具有单核苷酸分辨率。虽然已经取得了很大的进展，但仍未明确地确定可通过纳米孔分辨的最少碱基数目。我们的方法已将核酸序列转化成可被转化的更长的序列，以便序列得到保持。然后，更长的序列可通过纳米孔直接地读取。因此，进行转化的方式必须是快速的、高度可靠的和低成本的，并且需要开发进行该类转化的新方法。

发明概述