[发明专利]用于进行细胞测定的方法

说明书

发明领域

本发明涉及细胞测定或基于细胞的测定，尤其涉及用于这样的测定的深低温保藏细胞的提供。

发明背景

如同本领域的当前实践，药物发现是长时间的多步骤过程。首先，该过程涉及识别特定疾病靶标、开发基于特定靶标的测定、验证该测定、优化和接着使该测定自动化以进行筛选。随后可利用该测定进行化合物文库的高通量筛选(HTS)以鉴别表现出作为潜在药物的前景的候选化合物；接着验证并化学优化这些化合物。该过程得到先导化合物，先导化合物进入临床前试验，若经验证，则最终进入临床试验。在该过程中，筛选阶段与测定开发阶段不同，且包括测试化合物在活生物系统中的功效。

历史上，药物发现是费时的高成本过程，每种药物的产生历时多年并耗费数亿美元。基因组和HTS领域的发展已经引起靶标识别和化合物筛选领域中能力和效率的增加。

HTS技术的应用提供了解决和易化药物发现过程中当前遭遇的瓶颈的可能。在HTS方法中，针对在生物系统中的可能效果和所选先导化合物对特定靶标的特异性筛选候选药物。初级筛选已经由于HTS测定法和测定微型化的发展而解决，测定微型化采用96、384、1536或更多微型孔的微量滴定孔板形式，其能够达到超过100,000次试验/天的通量水平。

多种原本开发用于测量纯化蛋白质(主要是酶)的生化活性的无细胞测定可容易地通过应用不需要将反应产物与底物分离的检测系统而转变成HTS。例如，基于荧光的技术允许在不需要分离、分级或纯化步骤的情况下检测酶活性以及分子间相互作用(Hertzbamerg R P和Pope AJ.High-throughput screening：new technology for the 21st century(高通量筛选：21世纪的新技术).Curr.Opin.Chem.Biol.4，第445-451页，2000)。这些自动化测定使得能够快速筛选大的化合物文库，以鉴定所谓的“命中物(hit)”，即在离体的体外系统中对特定靶标的生化活性表现出所需效应的化合物。然后对命中物进行化学修饰，并通过HTS系统进一步筛选，以选择更具特异性和有效性的称为“先导”化合物的衍生物。在经典的药物发现过程中，随后利用细胞模型和动物模型在多种体内测定中测试先导化合物，以选择可成为临床试验候选药物的那些先导化合物。

近几年，对于药物发现过程早期的HTS，利用基因工程细胞和微生物的基于细胞的测定已经成为体外生化测定日益吸引人的备选方案。这样的测定需要检查由限定的靶标所引发的特异性细胞过程的能力和容易地在HTS系统中测定其输出的工具。越来越多可用的基因修饰细胞和微生物的生物技术工具的利用已使得能够开发简单的容易地应用于HTS的自动化系统的对于细胞过程的读出测定。

与传统体外生化测定相比，基于细胞的测定具有显著的优点。首先，这些细胞测定不需要纯化靶蛋白，因此消除了对获取用于获得生化活性靶标的必要知识的资源的投入—该优点已随着可被潜在药物治疗靶向的蛋白质数量日益增多而变得尤为重要，因为建立用于天然底物仍基本未知的数百新蛋白质的特异性生化测定实在困难。其次，靶蛋白的构象和活性以及用于监测化合物效果的读数在与体外测定相比较很可能更为接近地表现自然生理状态的细胞环境中研究。再次，基于细胞的测定可立即选择排除通常具有细胞毒性的化合物或不能穿过细胞膜到达胞内靶标的化合物。因此，通过基于细胞的测定确定的命中物和先导化合物已经通过了重要的验证步骤。该信息的可用性比许多体外测定领先，并可在药物开发中节省宝贵的时间和成本。

然而，近来用于药物发现(尤其是用于HTS)的细胞生长对细胞供应商和用户提出许多挑战；即，批量性能变化、细胞生产计划以及能力和容量管理。

细胞系通常每周传代培养两次并放大用于每次测定。该传代培养和放大通常在数月期间内循环重复。在大的单一批次中生长并保存于冰箱中的深低温保藏细胞的应用具有显著优点：(a)改善基于细胞的测定结果的一致性—一旦冷冻，同批细胞可在长时期内使用，(b)增加灵活性—新的测定可在需要测试化合物的任何时刻开始，以及(c)降低成本—节省在药物筛选活性同期将细胞系保持在培养物中所花费的时间。因此，减少了细胞培养试剂、一次性用品和细胞培养设备的使用。