[发明专利]分析荧光颗粒的方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种颗粒分析仪，更具体而言，本发明涉及分析颗粒如生物颗粒的方法和装置。

背景技术

生物化学和生物技术领域的多种现代技术都是以分析生物颗粒如细胞为基础。与颗粒的类型和种类，以及颗粒的状态如活力相关的多种参数都属于常规被研究的参数和性质。关于细胞内状态的进一步信息也经常被检测。在本领域中，冷光检测法，如荧光检测法，已经得到了广泛应用，主要归因于其固有的特异性及灵敏度。

对材料，例如生物材料的光致发光分析是基于以给定波长的光(激发光)照射样品，并在另一基本上不同的波长处收集从该样品、该样品某部分或组分发射出来的光(发射光)。激发光和发射光之间的波长差(通常称作斯托克斯位移)是被分析样品的一种特性，更概括地说是样品中存在的光致发光分子的特性。如果斯托克位移大到足以使激发光和发射光基本上光学分离，则可以应用光致发光法对材料进行分析。

光致发光的发射光(如磷光或荧光)往往比激发光强度低，通常低几个数量级。发射光是在“黑暗”下检测的事实使该方法更为适用，因为许多市售检测器对“黑暗”的反应性低而对撞击检测器的光(如光子)的反应性相当高。尽管如此，灵敏度提升，例如表示为发射光增加，往往是一种有利的特性，因此目前在现有技术中存在着大量实现该目的的方法。

产生发射光的几率与和光致发光分子相互作用的光子数量成比例，因此增加激发光强度通常会使发射光的量增加。一种常用的增加激发强度的方法是使用激光，激光可以用在某些发射光的量很强大的装置中，这不仅因为发射光的量(例如表示为能流)相当大，而且因为来自激光的光易于聚焦在小范围上，从而产生高的光密度(例如表示为单位面积的发射能量)。

另一种用于照射光致发光材料的方法是使用分散光源，例如灯或发光二极管。此类光源的优点是它们发射出分散光，可以照射相当大的面积。这些光源的一个共同的缺点往往是在获得很高程度的效率同时，该样品材料的均匀照射度相对较差，该效率由撞击该样品材料的发射光分数所限定。

通常优选用于生物分析的设备是显微镜，为了获得不同放大率通常配备两个或更多个物镜。此外，荧光检测需要特定波长的激发和发射滤光器。显微镜操作在一定程度上是自动化的，主要是实施图像分析。然而，即便有了这种自动化，显微镜的操作主要还是人工作业，需充分培训操作人员。

自动化流式细胞仪也用于分析诸如细胞等的颗粒。流式细胞仪是一大类设备的统称，它们的特征在于分析处于流动条件下的颗粒，这些条件通常可以每次分析一个单个颗粒。某些类型的流式细胞仪可对能获取的生物颗粒进行复杂的分析，但是流式细胞仪因为操作通常要求操作人员相当多的技能而难以使用。

本发明中的装置和方法也涉及细胞活力领域。细胞活力的测定对评估如药品、环境污染物、温度、离子极值和辐射等对细胞和组织的影响非常重要。细胞膜完整性通常被用作细胞活力的指标。膜完整性缺失的一个特征是形成了允许低分子量分子(MW＜小于2000道尔顿)进出细胞的孔。渗透性增强是许多细胞活力分析的基础。最常用的活力测量方法有⁵¹Cr释放法、台盼蓝拒染法以及不同荧光染料结合，以检测活细胞和死细胞。美国专利No.6,403,378描述了一种基于膜完整性的方法，该方法使用两种荧光染料，一种标记细胞膜受损的所有死细胞，而另一种标记所有活细胞。为了使用两种染料法获得不同细胞群和密度的可靠结果，关键是小心控制每种染料的用量以及用于使细胞染色的培养时间。活细胞的细胞质以及细胞核中不存在碘化丙锭(PI)和溴化乙锭(EB)，因此它们被认为是最常用的死细胞染色荧光示踪物。相反，吖啶橙(AO)和Hoechst-33342容易被活细胞吸收，因此常被用作活细胞染色的荧光探针。