[发明专利]在植物原生质体中使用双链RNA提高靶基因改变的效率

权利要求书

1.使植物细胞原生质体中靶基因改变的方法，其包括用以下物质转染原生质体：

优选地靶向植物MMR mRNA的dsRNA；和

突变核苷碱基。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述dsRNA和突变核苷碱基基本同时被导入植物细胞原生质体中。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述dsRNA和突变核苷碱基的导入最多间隔48小时。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述植物MMR mRNA是与MutS和/或MutL MMR基因相关的mRNA，更优选来自MSH2、MSH3、MSH6 MSH7 MLH1、MLH2、MLH3和PMS1。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述转染导致MMR基因的下调，优选是暂时下调。

6.如权利要求1所述的方法，其中在植物细胞原生质体中dsRNA是选择性地下调MMR系统(不会明显下调植物细胞原生质体中的其他mRNA种类)。

7.如权利要求1所述的方法，其中与在不存在dsRNA下基因改变的可比较方法相比，所述靶基因改变的效率增加了至少10倍。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物选自单子叶或双子叶植物。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述植物是茄科，优选番茄和/或烟草。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述突变核苷碱基包括一个或多个修饰核苷酸。

11.如权利要求11所述的方法，其中所述修饰核苷酸选自包含以下的组：

d、硫代磷酸修饰，优选在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；

e、丙炔取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；

f、LNA取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述突变核苷碱基包括至少一个修饰LNA，其处于距离至少一个错配至少一个核苷酸的位置，而且其中任选地所述突变核苷碱基含有最多大约75％LNA修饰核苷酸。

13.如权利要求9所述的方法，其中至少2，优选至少3，更优选至少4，甚至更优选至少5，最优选至少6个核苷酸是LNAs。

14.如权利要求11所述的方法，其中LNAs独立地分布距离错配两侧最多10个核苷酸，优选最多8个核苷酸，更优选最多6个核苷酸，甚至更优选最多4、3、或2个核苷酸。

15.如权利要求12所述的方法，其中2，优选3，更优选4，甚至更优选5，最优选6个核苷酸是LNAs。

16.如权利要求12所述的方法，其中最多50％的所述突变核苷碱基的修饰核苷酸是LNA衍生物，优选最多40％，更优选最多30％，甚至更优选最多20％，最优选最多10％。

17.如权利要求10所述的方法，其中至少一个所述修饰核苷酸是独立位于错配5’侧和/或3’侧。

18.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中位于错配5’或3’侧之一的两个LNA修饰核苷酸相互间隔至少一个，优选至少两个碱基对。

19.如权利要求9所述的方法，其中所述丙炔修饰核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述嘌呤是腺苷或鸟苷和/或嘧啶是胞嘧啶、尿嘧啶或胸苷。

21.如权利要求17所述的方法，其中至少10％的所述嘧啶和/或所述嘌呤被其分别的丙炔化衍生物所取代，优选至少50％，更优选至少75％，最优选至少90％。

22.如权利要求17所述的方法，其中所述修饰核苷酸是嘧啶。

23.如权利要求17所述的方法，其中所述修饰核苷酸是嘌呤。

24.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述在错配位置上的核苷酸是不修饰的。

25.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述至少一个修饰核苷酸不位于邻近错配，优选位于错配的2、3、4、6、7、8、9、或10个核苷酸之内。

26.如前述任意一项权利要求所述的方法，对于改变细胞，通过恢复至野生型校正突变，诱导突变，通过破坏编码区使酶失活，通过改变编码区修饰酶的生物活性，通过破坏编码区错配修复修饰蛋白，(植物)遗传物质的靶向改变，包括基因突变，靶基因修复和基因敲除。