[发明专利]在植物原生质体中使用双链RNA提高靶基因改变的效率

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是植物生物技术。本发明尤其涉及在dsRNA分子的存在下使用突变核苷碱基在植物原生质体中进行靶基因改变的方法。本发明进一步涉及提高靶基因改变的效率和使用该技术进行基因改变的应用。

背景技术

遗传修饰是为了修饰细胞的一个或多个遗传编码的生物特性而有意地在该活细胞或部分由细胞形成的生物体或可以再生的生物体的遗传物质上形成变化的过程。这些变化可以采取部分遗传物质的删除，外源遗传物质的添加，或现有遗传物质核苷酸序列的变化的形式。真核生物的遗传修饰方法已被获知超过20年，被广泛地应用于植物，人和动物细胞和微生物中，以在农业，人类健康，食品质量和环境保护领域获得改进。遗传修饰的常规方法包括：将外源DNA片段添加至细胞基因组中，然后由其赋予该细胞或它的生物体超越现存基因编码特性之上的新特性(包括由其抑制现存基因的表达的应用)。尽管许多这类示例可有效地获取期望特性，但是这类方法不是非常精确，因为不能控制插入外源DNA片段的基因组位置的对照(因此不能控制最终的表达水平)，因为期望效果必须在由原始且均衡基因组所编码的天然特性中显现。相反地，会导致预定基因组位点中核苷酸的添加，删除或转变的遗传修饰方法可实现现有基因的精确修饰。

定向于靶基因改变的突变核苷碱基(TGA)是基于将合成的突变核苷碱基(其是包含在Watson-Crick碱基配对特性上与DNA类似的短直核苷酸样基序，但在化学上区别于DNA的分子)递送至真核细胞核内的方法(Alexeev and Yoon，Nature Biotechnol.16：1343，1998；Rice，Nature Biotechnol.19：321，2001；Kmiec，J.Clin.Invest.112：632，2003)。通过在突变核苷碱基的同源序列上有意设计错配核苷酸，可以将该错配核苷酸拷贝至基因组DNA序列中。该方法实现了现有位点中单个或至多几个核苷酸的转变，但可应用于在现有基因上形成终止密码子由此破坏其功能，或形成密码子，其导致具有改变的氨基酸组成的基因编码蛋白(蛋白工程)。

已描述了在植物，动物和酵母细胞中的TGA。在这些研究中使用了两种不同类型的合成突变核苷碱基，嵌合DNA:RNA类型(嵌合体)或单链类型。