[发明专利]单重组体系及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单重组体系，其通过在经修饰的痘病毒载体中的单重组事件而克隆重组痘病毒(poxvirus)。本发明还涉及经修饰的痘病毒载体及其用途，以及制备重组痘病毒的方法。

背景技术

近来，人们致力于发展和改良基于重组痘病毒的技术。目前认为基于痘病毒的载体在许多用途中是有益的，这些用途例如为通过疫苗产生免疫应答、用于研制新疫苗疗法，以及在基因治疗应用中的用途。重组痘病毒载体的优点是众所周知的，其包括：将遗传物质高效运载至多种细胞类型中；高水平表达蛋白；以及具有诱发除了基于抗体的应答之外的细胞介导的免疫应答的能力。

众所周知痘病毒为细胞质病毒，因此通过该病毒载体携带的任何遗传物质通常留在细胞质中，并且不具有非特异性整合入寄主细胞基因组的缺点。使用(例如)克隆技术(如同源重组)，能够容易地对痘病毒进行遗传工程处理，使其包含和表达插入其基因组的外源基因。这些外源基因可编码许多种类的蛋白质，例如，可诱发针对一种或多种致病原(infectious agents)的保护机制的抗原、免疫调节蛋白(如协同刺激分子)、或酶蛋白。例如，已对重组痘病毒进行了遗传工程处理，以使其表达疱疹病毒、流感病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫抗原。

痘病毒作为载体的主要优点之一在于它们的基因组规模庞大，能插入包括(例如)多基因(即作为多价载体)在内的大量的异源遗传物质。但是，必须将异源遗传物质插入到痘病毒基因组中的合适位点，才能使重组病毒仍能保持活性。因此，必须将遗传物质插入到病毒DNA中的非必需位点上。

克隆重组痘病毒的已确立的方法是基于2个独立的重组事件的。在第一重组步骤中，将目的基因以及报告基因和/或标记盒整合到病毒基因组中。在筛选过程中，通常使用的是抗生素抗性基因。在随后进行的使用筛选/标记盒将重组痘病毒从重组和非重组病毒池中分离之后，如果意欲将重组痘病毒用于(例如)人类疫苗中时，应当删除筛选和标记盒。为此必须进行第二重组事件，其包括：对痘病毒进行进一步传代和噬斑纯化。因此，目前已知的用于克隆重组痘病毒的技术通常是费时费力的，当与通常用于克隆其它类型的重组表达载体的那些步骤相比较时尤其如此。

因此，在现有技术中，需要对克隆体系和方法进行改进，以有效地产生重组痘病毒。

发明概述

本发明基于一种经修饰的痘病毒载体，其通过单重组事件允许产生重组痘病毒。本发明所述的经修饰的病毒载体包含报告基因，其中当与目的插入物的重组成功发生后，所述报告基因就被删除。

本发明的第一方面涉及一种经修饰的痘病毒载体，其包含至少一个报告基因，其中所述报告基因位于用于同源重组的两个侧翼序列之间。在一个实施方案中，所述经修饰的痘病毒载体还包括至少一个筛选组件(selection component)，其中所述筛选组件在许可性寄主细胞中位于用于同源重组的两个侧翼序列之间。在另一个实施方案中，所述筛选组件包含筛选基因，其中所述筛选基因抑制或减缓痘病毒在寄主细胞中的复制，或对寄主细胞具有细胞毒性。在另一个实施方案中，所述报告基因和筛选组件位于用于同源重组的单一一对侧翼序列之间。在另一个实施方案中，所述报告基因和筛选组件位于用于同源重组的多于一对的侧翼序列之间。在进一步的实施方案中，所述筛选组件包含可被诱导表达的筛选基因。在具体实施方案中，所述报告基因编码荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白。在进一步的具体实施方案中，所述筛选组件包含筛选基因，所述筛选基因选自编码DNA酶、RNA酶或蛋白酶的基因。在进一步的具体实施方案中，筛选基因的表达是由调控序列控制的，所述调控序列优选为启动子。在另一个具体实施方案中，筛选基因由诱导表达体系调节，例如四环素操纵子/阻遏子体系(TetO2/TetR)。

本发明的另一方面涉及一种使用本发明的经修饰的痘病毒载体而产生的重组痘病毒。

本发明的另一方面涉及一种含有本发明的经修饰的痘病毒载体的寄主细胞。本发明另一方面涉及一种含有重组痘病毒的寄主细胞，其中所述重组痘病毒是使用本发明的经修饰的痘病毒载体而产生的。